UPLC法测定不同来源及其部位苦楝皮中川楝素的含量

王远敏，吴红梅＊，王祥培，冯 华，潘成莉，杨留波

（1.贵阳中医学院，贵州 贵阳550002；2.贵州省遵义市食品药品检验所，贵州 遵义563002）

苦楝皮为楝科植物川楝（MeliatoosendanSieb.et Zucc.）或楝（MeliaazedarachL.）的干燥树皮和根皮。始载于《证类本草》。具有清热、燥湿、杀虫的功效，用于蛔蛲虫病、虫积腹痛、疥癣瘙痒等症的治疗[1]。苦楝皮药材中主要含有川楝素、苦楝萜酮内酯、苦楝皮萜酮、苦楝萜酸甲酯、4，8－二羟基－1－四氢萘醌和儿茶素等化合物[2－6]。苦楝皮为多基源药材，市场上的苦楝皮药材包括川楝或楝的茎皮、枝皮、根皮等。杨烨[7]等比较了同植株不同部位来源的苦楝皮的挥发性成分发现，不同部位的挥发性成分存在差异，而不同品种、不同部位的苦楝药材中川楝素是否存在差异，目前未见文献报道，不利于苦楝药材资源的开发和合理利用。川楝素是从楝科植物川楝子和苦楝皮中提取的一种呋喃三萜类化合物，具有驱虫、抑制神经递质、抗肉毒等多种生物活性[8]，也具有抑制实体肿瘤体外增殖和诱导凋亡等作用，是治疗前列腺癌、神经母细胞瘤、肺腺癌、乳腺癌等实体肿瘤的活性成分[9－10]，且在2010版药典以川楝素为控制苦楝皮药材质量的指标，故试验以川楝素的含量为指标，建立川楝素高效、快速、简单的含量测定方法，并评价同植株不同部位来源的苦楝皮药材质量，以期为苦楝皮药材的质量控制、资源的合理开发利用及临床使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 药材、仪器与试剂

药材：川楝素对照品（批号：MUST－14031503，成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98%），26批苦楝根皮、茎皮、枝皮来自不同的地区和药店，包括湖北省、贵州省天柱县清浪村、贵州省麻江县黄坝村、贵州省贵阳市花果园药材市场、贵州省开阳县上坝、贵州省黔西县重新镇、贵州省龙里县湾寨乡、贵州省贞丰县者相镇、四川省新都区斑竹园、贵州省贵阳市南明区省委、贵州省六盘水市六枝特区蟠龙、贵州省贵阳市药用植物园、云南省保山市一心堂药房、四川省成都市杏林大药房、湖南省长沙青苹果健康药房，并干燥、粉碎，经贵阳中医学院王祥培教授鉴定为楝科楝属植物川楝或楝的干燥树皮和根皮。

仪器：Agilent1290超高效液相色谱仪（美国），带有四元泵溶剂洗脱系统、柱温箱、自动进样器；AL204－IC／万分析天平（METTLERTOLEDO 仪器有限公司），HS－10260T 超声波清洗机（天津市恒奥科技发展有限公司），HH－6数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）。

试剂：乙腈为色谱纯（美国TEDTA 公司），水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

1.2 供试品与对照品溶液的制备

将不同来源苦楝药材粉碎，过4号筛，取粉末约0.5g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，加热回流1h，放冷。再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.22μm 的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

精密称取川楝素对照品适量，置于25mL 的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成0.448mg／mL的对照品储备液。精密量取5mL储备液于10mL的容量瓶中，加甲醇定容，制备成0.224mg／mL 的对照品溶液。

1.3 色谱条件的考察

在色谱分离过程中考察乙腈－水、乙腈－0.01%甲酸水、甲醇－水等流动相系统，选择川楝素分离效果好的洗脱条件进行洗脱，考察不同流速（0.1mL／min，0.15mL／min，0.2 mL／min）对峰分离效果的影响，考察柱温（20℃，25℃，30℃，35℃）对分离度效果及分析时间的影响，考察DAD 检测器和ELSD检测器的灵敏度。

1.4 系统适应性试验

在最佳色谱条件下，分别吸取对照品溶液和供试品液注入液相色谱仪，考察川楝素对照品及样品与邻近峰的分离度及川楝素的理论塔板数。

1.5 线性关系与方法学考察

线性关系：分别取对照品溶液0.2μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL和3.5μL注入液相色谱仪。以峰面积为纵坐标（Y），样品含量为横坐标（X）制作工作曲线。

精密度：精密吸取对照品溶液1μL，重复进样6次，并计算川楝素的保留时间及峰面积的RSD值。

稳定性：取供试品溶液2μL，分别于0h，2h，4h，6h，8h，10h和12h进样测定，记录和计算川楝素的保留时间及峰面积的RSD值。

重复性：取四川省成都市杏林大药房的茎皮粉末（过4号筛）6份，精密称取0.5g，按1.2制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，计算川楝素含量的平均值及RSD值。

1.6 加样回收率试验

精密称取采于四川省成都市杏林大药房的茎皮粉末（过4号筛）6份，每份约0.25g，置于圆底烧瓶中，加入适量的川楝素对照品储备液，按1.2制备供试品溶液，按上述的色谱条件进行测定，计算回收率。

1.7 样品川楝素的含量测定

取26批不同来源的苦楝皮药材，按1.2制备供试品溶液，在最佳色谱条件下测定，记录色谱峰，以川楝素对照品作为对照，并计算川楝素的含量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件

经试验表明，在色谱柱为Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1×100 mm，1.8μm），流动相乙腈－水（34∶66），流速0.10 mL／min，柱温30℃，DAD 作为检测器，波长210nm，对照品进样量为1μL，样品进样量为2μL 时的分离效果最好，仪器灵敏度较高。

2.2 系统适应性试验

由图示可知，在对照品和供试品保留时间相应的位置都具有川楝素的色谱峰，且在供试品中的川楝素色谱峰不受其他峰的干扰。川楝素对照品结构中具有半缩醛结构，始终有2 个互变异构体存在。因此，试验以川楝素2个峰面积之和计算。川楝素与相邻峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按川楝素峰计算不低于8 000。

图示 川楝素对照品和苦楝皮药材供试品的UPLC色谱图Fig.The UPLC chromatogram of M.toosendanand M.azedarach

2.3 线性关系与方法学考察

由工作曲线得到川楝素的回归方程为y＝669.96x＋0.8195（R＝0.999 6）。川 楝素在0.044 8～0.784 0μg有良好的线性关系。

在同一台仪器上检测，其稳定性、精密度、重复性试验中的川楝素的保留时间和峰面积的RSD值分别为2.77%、1.67%和2.60%，且重复性试验计算四川省成都市杏林大药房的茎皮的川楝素含量为为11.58mg／g，RSD值为2.6%。表明，仪器的稳定性、精密度、重复性好。

2.4 加样回收率

由表1 可知，苦楝皮中川楝素的回收率在95%～105%，表明，试验结果准确、可靠。

2.5 不同来源苦楝皮中的川楝素含量

由表2可知，样品1～4、5～8、9～26为根皮、茎皮、枝皮部位，3个部位川楝素的含量都有差异。其中，18批茎皮的最高含量为2.22%，而最低含量为0.16%，两者相差10倍以上，差异较大，可能是受到产地、海拔、土壤、采收时间的影响；样品1、5、9，2、6、10，3、7、11，4、8、12来源于同植株的不同部位，其川楝素的含量差异也较大，但川楝素的含量都以根皮＞茎皮＞枝皮的顺序排列，显示次生代谢产物川楝素在植物根皮、茎皮、枝皮的分布极不均匀，表现出该成分由下至上的分布和积累趋势，同时也说明川楝素的含量可能受水分、无机盐、土壤等因素的影响。

表1 苦楝皮中川楝素的加样回收率Table 1 The recovery rates of M.toosendanand M.azedarach

表2 不同来源与部位的苦楝皮中川楝素的含量Table 2 Toosendain content in different source and part of M.toosendanand M.azedarach %

3 结论与讨论

试验表明，在色谱柱为Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1×100 mm，1.8μm），流动相为乙腈－水（34∶66），流速为0.10 mL／min，检测波长为210 nm，柱温为30℃，川楝素在0.044 8～0.784 0μg的线性良好，平均加样回收率为97.03%，RSD小于3%（n＝6），测定方法精确、可靠。

试验测定了共18批楝茎皮中川楝素的含量，结果发现各批次楝茎皮部位的川楝素含量差异较大，其中以贵州省天柱县清浪村的川楝素含量最高，为2.22%，贵州省开阳县上坝的川楝素含量最低，为0.16%，两者相差10倍以上。而不同产地的相同部位如根皮、枝皮中川楝素的含量差异也较大。提示苦楝皮川楝素的含量受药材产地、采收时间、加工炮制和土壤等因素的影响较大，故临床上使用苦楝皮药材时应注意影响其质量的因素，确保临床用药的安全有效。

考虑到不同植株同一采收期的含量有差异，为避免不同植株间的川楝素含量的差异，试验以楝同一植株进行不同部位的采样，以减少误差。通过测定湖北、贵州麻江黄坝村、贵州天柱县清浪等4个产地共12批同植株不同部位药材中川楝素含量发现，同植株不同部位药材川楝素的含量差异较大，都以根皮＞茎皮＞枝皮的顺序排列，说明川楝素在植株不同部位的代谢积累极不均匀，具有部位的选择性，可能受水分、无机盐、土壤等因素的影响，且根皮、茎皮、枝皮川楝素的含量符合或超过药典范围，从资源利用与保护角度，建议药材来源以枝皮为主。

2010 版药典规定，川楝素的含量应该在0.01%～0.22%，从收集到的26批药材来看，有5批药材在药典范围内，21批药材川楝素的含量都高于此范围。虽然川楝素是苦楝皮药材的主要药理活性成分，但已有研究证明川楝素可引起较严重的急性消化道不良反应，还可发生急性中毒性肝炎，出现转氨酶升高、黄疸、肝大叩痛等症状[11]。提示以楝的根皮、茎皮、枝皮作为苦楝皮药材来源，内服给药时应注意控制其质量，保证临床用药的安全性。

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