丁香酚对鲤鱼脑和脊髓中钠钾泵活性的抑制效果

孙文渊，吕世明＊，谭艾娟，林艳红，安 苗，华 夏，李博岩，焦亚琴

（1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳550025；2.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳550025）

钠钾泵简称钠泵，也称Na＋－K＋－ATP酶，是一种镶嵌在膜脂质双层中具有ATP 酶活性的蛋白质，广泛分布于各类细胞质膜上，在中枢神经系统，Na＋－K＋－ATP酶具有较高的生物活性。有研究表明，Na＋－K＋－ATP酶可能具有信号转导的作用[1－2]。丁香酚是一种有机化合物，主要用于抗菌、降血压等，且对多种水生动物有较好的麻醉作用[3]，其麻醉时间长、苏醒快，药物残留量少，对人和鱼均安全，但对其全麻作用的确切部位及分子机制仍不清楚，影响其在动物医学领域的深度开发和广泛应用。因此，为探明Na＋－K＋－ATP 酶是否为丁香酚作用的靶位之一，研究了鲤鱼在丁香酚麻醉下各脑区Na＋－K＋－ATP酶的变化，以期为了解丁香酚的作用机制和进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

试剂：丁香酚（Xiya Reagent），吐温80（Solar－bio），司班80（Xiya Reagent），无水乙醇（天津市武清区大良镇工业园），ATP酶试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

仪器：722 分光光度计（上海欣茂仪器有限公司），高速低温离心机（德国Eppendor）。

1.2 丁香酚乳剂的配制

参照吕世明等[3]的方法配制，即吐温80∶司班80∶无水乙醇∶丁香酚＝4∶2∶1∶2。

1.3 动物分组与处理

取体重900～1 000g、体长40～45cm 的鲤鱼40尾，先喂养7d以适应环境，水温20～22℃，试验前停食1d，随机分为对照组（10尾）、丁香酚处理组（30尾）。对照组：将鲤鱼放入不含丁香酚乳剂水溶液中药浴10min后取出，采集脑组织和脊髓，在生理盐水冰面上迅速分取大脑、中脑、小脑、间脑、延脑和脊髓，立即液氮冷冻保存备用。丁香酚处理组：将鲤鱼放置于含40mg／L丁香酚乳剂的水溶液中药浴，分别采集处于诱导期、麻醉期和麻醉恢复期的各10尾鲤鱼脑组织和脊髓，按对照组方法处理，液氮冷冻保存备用。鱼麻醉分期标准参照李思发[4]的方法执行。

1.4 Na＋－K＋－ATP酶活性测定

参照南京建成生物工程研究所提供的ATP 酶活力测定方法制备样品匀浆，考马斯亮兰法测脑组织的蛋白浓度，分光光度法测Na＋－K＋－ATP 酶活力，酶活力单位以每小时每毫克组织蛋白中ATP酶分 解ATP 产 生1 μmol 无 机 磷 的 量 表 示，即μmol／（mg·h）。

1.5 统计分析

试验数据以均数± 标准差表示，采用SPSS 17.0数据统计分析软件进行LSD多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同脑区和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶活性

从表1看出，对照组鲤鱼各脑组织中Na＋－K＋－ATP酶活性不同，以脊髓中最高，为（8.12±0.70）μmol／（mg·h）；小脑最低，为（4.87±0.05）μmol／（mg·h）。经丁香酚药浴后鲤鱼各脑和脊髓中的Na＋－K＋－ATP酶活性均不同程度下降，抑制作用随麻醉程度加深而加强，在麻醉期时抑制作用最强。与对照组相比，各脑和脊髓在麻醉期的Na＋－K＋－ATP酶活性均极显著下降；诱导期的大脑、间脑和脊髓的Na＋－K＋－ATP 酶活性均极显著下降，小脑的酶活性显著下降，中脑和延脑的酶活性下降但差异不显著。与麻醉期相比，恢复期除间脑和延脑外，其余各脑组织中Na＋－K＋－ATP酶活性均呈极显著升高，但仍低于对照组。

表1 试验鲤鱼不同脑区和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶的活性Table 1 Activity of Na＋ －K＋ －ATPase in different brain region and spinal cord of tested C.carpio

2.2 不同脑区和脊髓中Na＋－K＋－ATP 酶活性的抑制率

从表2看出，在诱导期，丁香酚对大脑和脊髓的Na＋－K＋－ATP酶活性抑制率大，分别达33.7%和37.6%；中脑和延脑的较小，分别为10.0%和12.4%。在麻醉期，丁香酚对脊髓的Na＋－K＋－ATP酶活性抑制率最大，达53.9%；对大脑、中脑、小脑和间脑的酶活性抑制率较接近，为32.5%～37.6%；对延 脑 的Na＋－K＋－ATP酶活性抑制率最小，为23.8%。在恢复期，各脑组织中Na＋－K＋－ATP 酶活性抑制率又降低，其中小脑中的降幅最大，其次是延脑和脊髓，大脑和间脑中的降幅较小。

表2 试验鲤鱼不同脑区和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶活性的抑制率Table 2 Inhibition rate of Na＋－K＋－ATPase activity in different brain region and spinal cord of tested C.carpio

3 结论与讨论

Na＋－K＋－ATP酶主要分布于机体具有分泌性和兴奋性的组织中，神经系统中含量尤为丰富。Na＋－K＋－ATP酶可通过改变细胞构象实现离子转运，产生并维持细胞膜电位，对维持神经细胞的兴奋产生和传导具有重要作用，并对神经递质的释放和信息传递也具有重要意义[5－6]。 另外，Na＋－K＋－ATP 酶也可借助Na＋／Ca2＋交换间接调节胞内Ca2＋浓度以调控神经递质的释放，影响神经细胞及神经细胞与肌肉或腺体细胞之间的信息传递[7－8]。所以，麻醉药影响Na＋－K＋－ATP 酶活性必将对神经元的电兴奋活动和信息传递产生影响。麻醉药对中枢神经系统Na＋通道、Na＋／Ca2＋交换及Na＋－K＋－ATP酶有抑制作用，通过扰乱Na＋，K＋，Ca2＋离子的稳定发挥其麻醉作用[9－11]。

研究结果表明，丁香酚可降低鲤鱼各脑区和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶活性，随麻醉程度的增加（从诱导期到麻醉期）抑制逐渐增强；酶活性抑制程度的变化与鲤鱼被丁香酚麻醉后出现的触觉丧失，鱼体平躺，直至静止水中的行为学变化相平行；从麻醉期到恢复期，丁香酚对各脑区和脊髓中Na＋－K＋－ATP酶活性的抑制逐渐减轻，酶活性逐渐恢复，与之平行的行为学变化表现出鲤鱼触觉恢复，游动越来越平稳灵活。表明，丁香酚对鲤鱼的麻醉作用与其抑制脑Na＋－K＋－ATP酶活性有关，即Na＋－K＋－ATP酶可能是丁香酚全麻作用的靶位之一。

全麻药的分子机制是一个非常复杂的过程，涉及跨膜细胞信号转导、细胞内信息转导和离子通道等方面的诸多内容[12－13]。目前，未见国内外有关丁香酚麻醉鱼类的分子机制研究报道。本研究结果在细胞跨膜信号转导方面揭示了丁香酚的全麻作用机制，其确切分子机制还有待进一步全面深入研究。

[1]文玉杰，李晓玫.钠钾ATP酶的信号转导功能新进展[J].生理科学进展，2005，36（2）：59－162.

[2]Gang W，Kiyoshi K，Gregory G.Divergent signaling pathways mediate induction of Na＋，K＋－ATPaseα1 anβ1subunit gene transcription by low potassium[J].Molecular and cellular biochemistry，2007，294（4）：73－85.

[3]吕世明，蔡洪能，谭艾娟，等.丁香酚乳液和醇溶液对鲤鱼麻醉作用的对比研究[J].天津农业科学，2009，15（3）：1－3.

[4]李思发.鱼类麻醉剂[J].淡水渔业，1988（1）：22－23.

[5]Schuurmans－Stekhoven F，Bonting S L.Transport adenosine triphosphatases：Properties andfunction[J].Physiological Reviews，1981，61（1）：1－76.

[6]Oashi T，Uchida S，Nagai K，et al.Studies on phosphate hydrolyzing activities in the synapticmembrane[J].The Journal of Biochemistry，1970，67（5）：635－641.

[7]成同怡，吴本阶.Na＋，K＋－ATP的结构和功能[J].国外医药：分子生物学分册，1990，12（5）：236－238.

[8]Stojanoric T，Mrsulja B R.Alteration in synaptosmal membrane，Na＋，K＋－ATPase of the gerbilcortex and hippocampus following reversible brain ischemia[J].Metabolic Brain Disease，1988，13（4）：256－310.

[9]Lysko P G，Webb C L，Yue T L，et al.Neuro protective effects of tetrodotoxin as a Na＋channel modulator and glutamate release inhibit or in culture rat cerebral neurons and in geroil brain ischemia[J].Stroke，1994，25（12）：2476－2482.

[10]Rehberg B，Xia Y H，Duch D S.Central nervous system sodium channel are significantly suppressed at clinical con cent rations of volatile anesthetics[J].A nest hesiology，1996，84（6）：1223－1233.

[11]Kulkarni R S，Rehberg B，Jean－Louis H，et al.Inhibitory effects of ketamine and halothane on recombinant potassium channels from mammalian brain[J].Anesthesiology，996，84（6）：900－99.

[12]范宏刚，卢德章，王洪斌，等.替来他明及小型猪复方麻醉剂（XFM）对大鼠不同脑区一氧化氮和一氧化氮合酶的动态影响[J].中国兽医杂志，2008，44（10）：12－15.

[13]王洪斌，范宏刚，胡 魁，等.噻环乙胺对大鼠不同脑区NOS 活性及NO 产量和cGMP含量的影响[J].畜牧兽医学报，2008，38（11）：1599－1605.