绵羊肺炎支原体的分离鉴定及其HSP70基因遗传多样性

胡政香，乔 军，孟庆玲＊，张金生，陈创夫

（1.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子832003；2.新疆沙湾县兽医站，新疆 沙湾832100）

绵羊支原体肺炎（Contagiousovinepleuropneumonia）又称绵羊传染性胸膜肺炎，是由绵羊肺炎支原体（Mycoplasmaovipneumoniae，MO）引起的一种高度接触性传染病，是以咳嗽、气喘、发烧、渐进性消瘦及肺的间质增生性炎症为特征的呼吸道疾病，主要危害1～3月龄的羔羊，呈急性或慢性经过，病死率一般为30%～50%，有时高达80%～100%[1－6]。绵羊肺炎支原体自1963年首次分离报道后，相继在多个国家分离到该病原。我国于1979年在四川阿坝首次发现该病，由新西兰和澳大利亚进口的边区莱斯特种羊带入，此后在多个省区分离到MO[7－12]。近年来，MO 导致羊患传染性胸膜肺炎病例日趋增多，给养羊业发展造成了巨大的经济损失，但MO的研究却相对滞后，特别是对于其重要功能蛋白如重要抗原及毒力因子等的研究甚少。

热休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）是一种结构上高度保守的多肽，能够通过易化变性蛋白的修复，帮助新合成多肽键的生理折叠与伸展，以及纠正多肽链的错误折叠等途径使细胞的功能和结构得到恢复，具有“分子伴侣”的功能[13]。 王枫等[14]通过构建果蝇HSP70缺失突变体发现，HSP70 对热应激是必需的。Gomez F J等[15]从有荚膜的组织胞浆菌的细胞壁和细胞膜上分离得到HSP70同源性的抗原物质，这种物质能诱导小鼠的细胞和体液免疫反应，并能引起有效的免疫保护作用。许键等[16]采用随机扩增多态性及限制性片段长度多态性方法，对26 株MO 国内分离株进行多态性研究表明，我国MO 存在高度的基因多态性，这种多态性与地域差异相关，与宿主来源也具有一定的相关性。为绵羊支原体肺炎的科学防控提供理论依据，从新疆塔城地区7个羊场疑似MO感染绵羊的病变肺组织进行病原分离，通过形态学、生化试验及分子生物学等试验对分离株进行鉴定，并对HSP70基因遗传多样性进行检测。

1 材料与方法

1.1 病料

从新疆塔城地区塔城市（T）、额敏县（E）、裕民县（Y）、托里县（L）、乌苏市（W）、沙湾县（S）和布克赛尔蒙古自治县（H）7个羊场采集疑似绵羊肺炎支原体感染病死羊肺脏，按1∶10加入生理盐水中，研碎，3 000r／min离心10min，以0.22μm 滤器过滤。

1.2 主要试剂

KM2液体培养基，购自江苏农业科学院，在KM2培养基中加入1%低熔点琼脂糖液，制备4%的固体培养基。葡萄糖、水解精、尿素、美兰牛乳等细菌微量生化反应管，购自杭州天和微生物试剂有限公司。DNA Marker DL2000、pMD19－T 载体、蛋白Marker等，购自TaKaRa公司。

1.3 病原分离及鉴定

1.3.1 分离 取0.4mL 滤液接种于4mL KM2液体培养基中，于37℃、5% CO2条件下培养3～6 d，当培养基由红色变为黄色时，取液体培养物接种于KM2固体培养基，培养7d，在低倍显微镜下挑取单个菌落接种于液体培养基继续培养，待培养物颜色明显变化后再次接种固体培养基，重复3次。

1.3.2 形态学鉴定 取纯化的培养物接种于KM2固体培养基，于37℃、5%CO2、湿度80%条件下培养，5～7d 后革兰氏染色，在倒置显微镜下观察菌体形态。对菌落进行Dienes染色，利用倒置显微镜观察菌落中心颜色是否为蓝色。

1.3.3 生化特性鉴定 分别在葡萄糖、精氨酸、尿素微量生化反应管中接种分离株，在37℃、5%CO2条件下培养5d，观察颜色变化。在菌株单个菌落生长良好的平板上加入0.5%豚鼠红细胞2mL，置于37℃培养20 min 后倾去红细胞悬液，用PBS 10mL冲洗5次，在低倍镜下观察红细胞吸附于菌落上的情况。用含10%绵羊脱纤血的固体培养基接种各鉴定株，于37℃、5% CO2条件下培养3～5 d，在显微镜下观察是否有溶血现象。

1.3.4 分子生物学鉴定 用病毒提取试剂盒提取DNA 全基因组DNA。利用MO 特异性引物16S rRNA（P1：5′－GACTTCATCCTGCACTCTGT－3′，P2：5′－TGAACGGAATATGTTAGCTT－3′）对 分离物进行PCR 鉴定。反应体系：预混酶12.5μL，水5.5μL，引物各1μL，模板5μL。反应条件：95℃180s；95℃30s，55℃40s，72℃50s，35个循环；72℃延伸10min。PCR 产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将PCR 扩增产物克隆入pMD19－T 载体中，送华大有限公司测序，用DNAMAN 软件对15 株分离株的16SrRNA 序列同源性进行分析。

1.4 HSP70基因的扩增、克隆及其遗传多样性分析

根据MOHSP70 基因序列，设计特异性引物对5株分离株的HSP70 基因全长进行扩增，克隆入pMD19－T载体中测序，利用生物在线分析软件（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／，http：／／www.expasy.org／tools／）分 析HSP70 序 列的二级及三级结构、糖基化位点和磷酸化位点，用DNAMAN 软件进行遗传多样性分析，用MEGA 5.0软件构建HSP70基因系统进化树。

2 结果与分析

2.1 病原的特征特性

2.1.1 形态学特征 纯化培养物用固体培养基培养4d后可观察到针尖状大小的菌落，菌落呈圆形、无脐、边缘整齐、乳头状（具有1个致密突出的中心点）。培养物切片在油镜下观察，菌体被染成红色，呈多种形态（图1）。菌落经Dienes染液染色，其中心被染成深蓝色、边缘染色浅，而其他细菌不着色，20min内不褪色（图2）。

图1 分离菌株的菌落形态及菌体染色形态Fig.1 Colonial morphology and thallus staining of isolated strains

图2 分离菌株菌落的Dienes染色形态（80×）Fig.2 Dienes staining of isolated strains（80×）

表 15株分离菌株的生化鉴定结果Table Biochemical identification of 15isolated strains

2.1.2 生化特性 从表中看出，15株分离菌株的生化特性表现相同，能发酵葡萄糖、不水解精氨酸与尿素、美蓝牛乳褪色、吸附红细胞并导致溶血。

2.1.3 分子生物学特性 从15株分离株基因组总DNA 中扩增出361bp的16SrRNA 片段，与预期片段大小相符（图3）。与MO 标准毒株Y98（U44771）株16SrRNA 相比，T1、S2、E2、W2分离株的核苷酸同源性为100%，S3分离株为97.81%，T2、Y1、E1、L1、L2、W1、S1、T3、S4、H1分离株分别为96.08%、96.12%、95.8%、94.47%、94.92%、97.07%、98.52%、98.27%、98.69%和97.17%。

图3 15株分离菌株的PCR 扩增电泳图谱Fig.3 PCR amplification electrophoretogram of 15isolated strains

2.2 HSP70基因的克隆及序列

经测 序，分 离 株L1、W2、H1、T1 和E2 的HSP70基因大小均为747bp，编码248个氨基酸。编码的HSP70蛋白二级结构以α－螺旋、延伸链和无规卷曲为主；三级结构呈1个完整的Y 字形三维立体结构；含有2 个潜在的N 末端糖基化位点（Asn14，Asn78）；12 个磷酸化位点（Ser16，Ser21，Ser25，Ser28，Ser44，Ser51，Ser54，Ser80，Ser203，Ser211，Tys169，Tys208）。5 株分离株的HSP70基因核苷酸同源性为94.1%，氨基酸同源性为93.2%，与MO 标准毒株Y98 相比，L1、W2、H1、T1、E2有54 个、43个、53个、43个和53个核苷酸变异位点并在第593位点均插入Gln（谷氨酰胺），说明分离株发生了遗传变异。基于HSP70基因的系统进化树（图4）表明，5 株MO 分离株均聚在同一支上，且与猪肺炎支原体（M ovipneumoniae SC01）的同源性较高，而与MO 标准毒株Y98不在同一支。

图4 基于NJ法构建的HSP70基因系统树Fig.4 Phylogenetic analysis of HSP70gene based on NJ method

3 结论

通过KM2培养基，从新疆塔城地区疑似绵羊肺炎支原体感染病死羊肺脏中分离到15株绵羊肺炎支原体疑似分离株，分离株呈典型的乳头状菌落，可使葡萄糖酵解产酸、不水解精氨酸和尿素、使美兰牛乳褪色、具有溶血及吸附红细胞的特点。通过对分离株16SrRNA 基因序列PCR 扩增和测序，证明15株分离株均为绵羊肺炎支原体。

在成功克隆5 株绵羊肺炎支原体新疆分离株HSP70基因的基础上，对其基因序列和遗传多样性分析，核苷酸的同源性为94.1%，氨基酸同源性为93.2%；与绵羊肺炎支原体标准毒株Y98相比，5株新疆分离株在593位点均插入Gln（谷氨酰胺），表明，不同地域绵羊肺炎支原体流行株HSP70具有较明显的遗传多样性，这可能与绵羊肺炎支原体适应环境相关。

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