香猪肺源性枯草芽孢杆菌的分离鉴定及体外抑菌作用

陈 江，冉雪琴，王嘉福＊

（1.贵州大学 农业生物工程研究院，贵州 贵阳550025；2.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳550025；3.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳550025）

芽孢杆菌（Bacillussubtilis）对动物和人的病原菌有显著拮抗作用，因而引起人们的关注[1]。在体外，枯草芽孢杆菌能够显著抑制产肠毒素大肠杆菌K88、鼠伤寒沙门氏菌SL1334的粘附，并抑制鼠伤寒沙门氏菌的内化作用[2]。在体内，枯草芽孢杆菌与病原菌竞争宿主细胞的粘附位点，抑制病原菌对宿主细胞的侵染；同时，促进乳酸杆菌等有益厌氧菌的生长[3]。枯草芽孢杆菌可产生脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类化合物和氨基酸类等抑菌物质，达到抑制病原菌的作用[4]。猪的常见病原菌有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌等，主要引起仔猪腹泻和水肿病、化脓性感染、猪链球菌病等。从江香猪等地方猪品种对这类疾病具有较强的抗性[5]，但其抗病机理不明。为此，笔者以从江香猪为试验材料，从肺部分离到1株枯草芽孢杆菌Bp－1，并对其抑制病原菌的活性进行研究，以期为从江香猪等地方猪抗病机理的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株样本

产志贺样毒素Stx2e大肠杆菌P22，为贵州大学农业工程重点实验室从贵州本地仔猪水肿病粪样中分离[6]。金黄色葡萄球菌S1（Staphylococcus aureus），为贵州大学生命科学学院微生物研究室赠送[7]。猪 链 球 菌 （Streptococcussuisserotype 2，SS2）CVCC607，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，为Ⅱ型猪链球菌致病株。

1.2 菌株分离

选取猪肺组织，以适量PBS缓冲液对猪肺进行灌洗，按梯度稀释法稀释菌悬液[8]，涂布于LB 平板上，37℃、200r／min振荡培养18h，挑取单菌落加入液体LB培养基中增菌，固体LB平板上划线分离单菌落。

1.3 生理生化鉴定

取少量菌落制片，经革兰氏染色，显微镜下观察细菌的形态。生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[9]进行，细菌微量生化反应管购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.4 16SrDNA序列测定及二级结构分析

采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[10]抽提分离细菌的基因组DNA。原核生物16SrDNA 通用引物序列：27f，5′－GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′，1541r，5′－AAGGAGGTGAT CCAGCCGCA－3′，以细菌基因组DNA 为模板进行PCR 扩增，采用50μL 反应体系，反应条件：预变性94℃5 min；94℃30s，52℃30s，72℃1 min，30个循环；72℃延伸8min。PCR 产物纯化和测序由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。将获得序列与NCBI GenBank库中的已知序列进行比对，用Mega v6.0软件Neighbor－joining 法构建系统进化树，采用Bootstrap法1 000 次检验可信度。通过mfold在线平台分析16SrRNA 序列的二级结构。

1.5 体外抑菌试验

分离细菌培养24h，8 000r／min 离心10min，取上清液，将滤纸片（直径0.8cm）浸泡于上清液中15min。分别取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌菌液100μL，均匀涂布于营养琼脂平板上，放上浸湿的滤纸片，静置3min，37℃培养2 ～48h，观察抑菌情况[11]。用游标卡尺测抑菌圈的直径（diameter of antibiotic circle），以抑菌圈的直径表示抑菌活性。

1.6 对致病菌的拮抗试验

将分离细菌分别与大肠杆菌P22、金黄色葡萄球菌S1 和猪链球菌CVCC607 按2∶1 接种于50mL LB 液 体 培 养 基 中[12]，以 P22、S1 和CVCC607单独培养为对照，37℃、170r／min 振荡培养，分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、24h和48h取样革兰氏染色，用平板菌落计数法测定每种细菌的数量（cfu／mL），重复计数5 次取平均值，计算致病菌与分离菌的数量之比[13]。

2 结果与分析

2.1 菌株分离和鉴定

采用灌洗法从香猪肺组织液筛选到1 株细菌Bp－1，菌体呈短杆状，染色均匀，具运动性，兼性厌氧，存在内生芽孢，芽孢囊膨大呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，革兰氏染色阳性（图1）；在LB 培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则。生化反应结果显示，菌株Bp－1可利用L－阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、乳糖、甘露醇产酸，还原动力－硝酸盐；接触酶、氧化酶阳性；能利用果胶、柠檬酸盐，不能利用丙二酸盐，可水解马尿酸盐、淀粉、酪氨酸，能使明胶液化。

图1 菌株Bp－1革兰氏染色Fig.1 Gram staining of strain Bp－1

2.2 16SrDNA基因序列与同源性

以Bp－1基因组DNA 为模板，利用引物27F／1541R进行PCR 扩增，得到单一条带（图2）。PCR产物经回收纯化测序，大小为1 429bp，NCBI收录号为KP229430。

图2 Bp－1菌株16SrRNA基因片段的扩增Fig.2 Amplification of 16SrRNA gene segment of strain Bp－1

经比对，Bp－1 基因序列与枯草芽孢杆菌16S rRNA 基因序列的同源性最高，为99%～100%。以16SrDNA 序列同源性为基础构建系统进化树（图3），菌株Bp－1 与Bacillussubtilis（KF318713）等的相似性为100%，位于同一分支。

图3 以16SrDNA序列为基础的Bp－1菌系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain Bp－1based on 16S rDNA sequence

2.3 16SrRNA的二级结构

依据Bacillussubtilisstrain168菌株（ATCC 21331）序列，运用mflod 在线平台分析16SrRNA的二级结构。结果表明，16SrRNA 有9个可变区，即V169－99、V2137－242、V3433－497、V4576－682、V5822－879、V6986－1043、V71117－1173、V81243－1294和V91435－1465[14]。Bp－1 与B.subtilis168间共有6个碱基不同，只有1个碱基（A235G）处于V2区中（表），其他5个差异碱基落在可变区外。

表 菌株Bp－1 和B.subtilis strain 168的16SrDNA差异位点Table Different 16SrDNA loci of strain Bp－1and B.subtilis strain 168

图4 菌株Bp－1和B.subtilis 168的16SrRNA和V2区二级结构比较Fig.4 The secondary structure of strain Bp－1，B.subtilis 168and V2region

Bp－1和B.subtilis168的16SrRNA 二级结构均由6个茎、2个发卡环、4个内环和1个突变环组成。在V2区内Bp－1与B.subtilis168只有235位的1个碱基不同，B.subtilis168为G，Bp－1为A；该碱基处于环中，没有改变16SrRNA 分子的二级结构（图4）。综合菌株Bp－1的生理生化特征、16SrDNA 核苷酸序列和16SrRNA 二级结构分析，将Bp－1 鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。

2.4 Bp－1对3种致病菌的抑制作用与拮抗作用

枯草芽孢杆菌Bp－1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌的抑制作用均在培养4h 时达最高值，之后缓慢下降。4 ～12h抑菌效果：金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞猪链球菌；14 ～18h抑菌效果：大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞猪链球菌；24h后只对大肠杆菌有抑制作用（图5）。

图5 枯草芽孢杆菌Bp－1对致病菌的抑制和拮抗作用Fig.5 Effect of strain Bp－1on inhibition and antagonism of pathogenic bacteria

枯草芽孢杆菌Bp－1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌均呈现一定的拮抗作用，总体上枯草芽孢杆菌Bp－1对大肠杆菌的拮抗作用最强，对金黄色葡萄球菌的拮抗作用较弱（图5）。

3 结论与讨论

试验在从江香猪肺组织液中分离到1 株细菌Bp－1，菌株的16SrDNA 核苷酸序列与B.subtilis168的相似性为99%，有6个碱基不同，其中只有1个碱基A235G 位于可变区V2中，此碱基处于环中，没有引起16SrRNA 二级结构的变化，结合形态学特征和生理生化检测将其鉴定为枯草芽孢杆菌（B.subtilis）。

枯草芽孢杆菌Bp－1对产志贺样毒素Stx2e大肠杆菌P22、金黄色葡萄球菌S1和猪链球菌3种致病菌均有一定的抑制作用。在固体培养基上，菌株Bp－1上清液对3种致病菌的抑制作用均在4h时达最高值，之后缓慢减弱，对金黄色葡萄球菌S1和大肠杆菌P22的抑制作用较强，对猪链球菌CVCC607的抑制作用最弱，表明菌株Bp－1的培养液中含有抑菌物质。当枯草芽孢杆菌Bp－1与病原菌在相同的液体环境中生长时，Bp－1对3种病原菌的拮抗作用发生了变化，总体上对大肠杆菌P22的抑制作用较强，对金黄色葡萄球菌S1的抑制作用较弱。微生态学生物颉颃理论认为，枯草芽孢杆菌能产生生物酶、乳酸、丙酸、过氧化氢和细菌素等物质，同时枯草芽孢杆菌与病原菌竞争营养和氧气，抑制病原菌的生长[15]。病原菌可以将枯草芽孢杆菌分泌的抗菌物质进行分解或利用，导致液体环境中的抗菌物质减少[13，16]，也会 导 致Bp－1 的 抑 菌 作 用 减 弱。 试 验 结果表明，3种病原菌对枯草芽孢杆菌产生的抑菌物质的敏感性有差异。已有研究证明，枯草芽孢杆菌可以产生芬枯草菌素（fengycinA、B）、抗菌肽、伊枯草菌素（iturin）等物质[17]，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌对这些抗菌肽的敏感性明显不同[18]。

香猪肺源性枯草芽孢杆菌Bp－1对致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌均有抑制作用，Bp－1可作为益生菌对其进行深入研究。

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