山莓茎皮总黄酮的提取及其抗氧化活性

2015-07-01石登红蒋华梅王向前

贵州农业科学 2015年6期

石登红，蒋华梅，刘燕，王向前

（1.贵阳学院生物与环境工程学院，贵州贵阳550005；2.贵阳学院化学与材料工程学院，贵州贵阳550005；3.贵阳学院图书馆，贵州贵阳550005）

山莓（RubuscorchorifoliusL.F.）又名悬钩子、三月泡、山抛子、四月泡、刺葫芦、馒头菠、高脚菠、泡儿刺，系蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（Rubus）中的一种落叶灌木[1]，野生资源除我国东北、甘肃、西藏、新疆、青海外，各省均有分布。山莓的根、茎、叶和果实均可入药，有活血、解毒、止血等功效，是一种民间常用的苗族药[2]。有关山莓果实的资源利用[3－5]、营养成分分析等[6]研究已有文献资料报道。山莓栽培利用已成为传统的重要水果[7－8]。但是，目前研究山莓叶的化学成分和药用价值方面的文献资料甚少[9－16]，国内外对山莓的研究仍集中在资源利用、叶的药用及果实食品加工等方面。

悬钩子属植物中黄酮类化合物的提取研究已有相关研究报道[17－18]，但是对山莓茎皮黄酮类物质的提取和抗氧化性方面的研究尚未见报道。山莓资源在各地分布广泛，为深入研究山莓茎皮的药理活性物质，提高山莓的药用价值，笔者以贵州野生山莓为试验材料，利用有机溶剂回流提取法，正交试验设计，对山莓茎皮中的总黄酮进行提取，并用分光光度法测定总黄酮含量，首次对山莓茎皮黄酮清除ABTS和DPPH自由基能力进行研究，以期为贵州野生山莓茎皮提取物进一步分离纯化、抗氧化活性试验、单体分析等奠定基础，为挖掘山莓茎皮的药理作用、充分开发利用山莓资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

野生山莓茎皮采自贵州贵阳，采摘时间为3月，以当年生嫩枝为主，分别采集山莓植株的上、中、下部位和四周，共采集20g，100℃恒温干燥后研碎备用。

试剂为硝酸铝Al（NO3）3、亚硝酸钠（NaNO2）、无水乙醇（CH3CH2OH）、氢氧化钠（NaOH），均为分析纯，芦丁为标准品≥97%（120℃干燥至恒重），ABTS和DPPH 均采自由Sigama公司提供。

仪器：UV－2550型紫外可见分光光度计（日本岛津）、电子天平（美国奥豪斯）。

1.2 芦丁标准溶液的配备

精密称取芦丁标准品2.5mg于10mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，浓度为0.25mg／mL。

1.3 测定波长的选择

采用Al（NO3）3法，参考文献资料[16，19]精密移取上述芦丁标准品溶液1 mL 于10 mL 比色管中，稀释至2.40 mL，加5%亚硝酸钠0.40 mL，摇匀，6min后加入10% Al（NO3）3水溶液0.40mL，摇匀放置6min，再加4% NaOH 4.00mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置15min。以不加NaNO2的溶液为空白，采用紫外－可见分光光度法，在波长400～800nm扫描[16－17]，以最大吸光度的波长为测定波长。

1.4 芦丁标准曲线的绘制

精密移取芦丁标准品溶液0.00mL、0.01mL、0.02mL、0.03mL、0.04mL、0.05mL和0.06mL分别置于10 mL 的比色管中，按照1.3 的步骤稀释，摇匀，最后静置15min，用紫外－可见分光光度计在506nm 波长下测定上述溶液的吸光度，以吸光度A 为纵坐标，稀释后各芦丁标准溶液浓度C 为横坐标，绘制标准曲线，计算芦丁标准溶液的回归方程及相关系数：C＝0.0911×A－0.0025，R2＝0.997 3。

1.5 山莓茎皮总黄酮的测定

准确移取山莓茎皮提取液各0.5mL，按1.3的方法显色，并测定吸光度，将吸光度值代入芦丁标准曲线方程求出待测样品的浓度，根据公式：样品总黄酮质量（mg）＝浓度×10×100／0.5，总黄酮含量（mg／g）＝样品总黄酮质量／样品质量，计算各样品总黄酮质量和含量。

1.6 不同因素的考察

1.6.1 乙醇浓度称取1g的山莓茎皮粉末4份分装入250mL烧瓶中，分别加入60%、70%、80%、90%的乙醇溶液各30mL，70℃回流提取2h，抽滤，收集滤液，同样条件下重复提取1次，合并滤液，用相应浓度的乙醇定容到100mL的容量瓶中，按1.5的方法进行总黄酮的测定（下同）。

1.6.2 料液比称取1g山莓茎皮粉末4份分装于250mL 烧瓶中，分别加入料液比（g／mL）为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的70%乙醇溶液，80℃回流提取2h，抽滤，收集滤液，同样条件下重复提取1次，合并滤液，定容到100mL的容量瓶中。

1.6.3 回流温度称取1g山莓茎皮粉末4份分装于250mL烧瓶中，加入70%乙醇溶液各30mL，分别在50℃、60℃、70℃、80℃回流提取2h，抽滤，收集滤液，同样条件下重复提取1次，合并滤液，定容到100mL的容量瓶中。

1.6.4 提取时间称取1g山莓茎皮粉末4份分装于250mL烧瓶中，加入70%乙醇溶液各30mL，于80℃分别回流提取2h、3h、4h、5h，抽滤，收集滤液，同样条件下重复提取1次，合并滤液，定容到100mL的容量瓶中。

1.7 山莓茎皮总黄酮提取条件的优化

根据单因素试验结果，以乙醇浓度（A）、料液比（B）、回流温度（C）和提取时间（D）为考察因素，以山莓茎皮总黄酮含量为指标，采用L9（34）进行正交试验，其因素水平见表1。

表1 山莓茎皮总黄酮提取的L9（34）正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels for L9（34）orthogonal test fromR.corchorifolius stem barks

1.8 抗氧化活性试验

1.8.1 清除ABTS自由基精密称取0.096 0g ABTS，蒸馏水溶解、定容至25 mL 容量瓶，浓度7mmol／L，记为试剂1。称取0.378 4g K2S2O8（过硫酸钾），蒸馏水溶解、定容至10 mL 容量瓶，浓度140mmol／L，记为试剂2。精密吸取5 mL 试剂1于10mL容量瓶，加入88μL 试剂2，摇匀，避光放置12～16h，即为ABTS储备液。移取一定体积的ABTS 储备液，用75% 乙醇溶液稀释100 倍，732nm测吸光值在0.7±0.0。按上述1∶100的比例配制ABTS溶液用于清除ABTS自由基试验。

样品溶液：吸取正交试验中总黄酮含量较高的溶液0.5mL，用75%乙醇稀释至3 mL，即为样品溶液。

分别取样品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL、55μL、60μL和65μL，用75%乙醇将样液稀释至0.5mL，每管中加入0.3mmol／L的ABTS溶液2.5mL，振摇10s以上，避光静置10min，用75%乙醇作空白对照，于742nm 下测吸光度值，计算清除率。BHT样品溶液浓度1.5 mmol／L，分别取BHT 溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL和50μL按上述步骤进行清除ABTS试验，计算清除率。

式中，A0为空白对照吸光度，A样为样品吸光度。根据浓度与清除率求出一元线性方程、相关系数，计算半数清除率IC50值。

1.8.2 清除DPPH 自由基分别吸取正交试验总黄酮含量较高的样品溶液0.02 mL、0.04 mL、0.06mL、0.08 mL、0.10 mL、0.12 mL、0.14 mL、0.16mL和0.18mL于10mL比色管中，用75%乙醇溶液定容至4 mL，振荡摇匀，分别加入0.3mmol／L的DPPH 溶液4 mL，振荡摇匀，空白对照为75% 乙醇，常温避光反应60 min 后于523nm测吸光度值，采用以下公式计算清除率[11]。BHT 样品溶液浓度7.5 mmol／L，分别取BHT 溶液0.02 mL、0.04 mL、0.06 mL、0.08 mL、0.10mL、0.12mL、0.14mL、0.16mL、0.18mL和0.20mL按上述步骤进行清除DPPH 试验，计算清除率。

2 结果与分析

2.1 不同因素对山莓茎皮总黄酮含量的影响

由表2可知，不同乙醇浓度、料液比、回流温度、提取时间对山莓茎皮中总黄酮提取率均有影响。

1）乙醇浓度。随乙醇浓度升高总黄酮提取率逐渐降低，当乙醇浓度超过90%以后提取率下降最明显。因此，选择60%、70%、80%的乙醇浓度作为正交试验的3个水平。

2）料液比。在同等条件下，料液比与总黄酮提取率成正比，当料液比在1∶20～1∶40时，提取率增加显著，超过1∶50后提取率增加缓慢。考虑到实际生产的效益，选择料液比1∶30、1∶40、1∶50作为正交试验的3个水平。

3）提取温度。提取温度在50～70℃，总黄酮提取率随温度的升高而显著增大，但温度为80℃时提取率降低。因此，选择提取温度60℃、70℃、80℃作为正交试验的3个水平。

4）提取时间。总黄酮提取率随提取时间的增加而增大，可见提取时间越长，总黄酮提取越充分，但当时间超过3h时，提取率明显下降。同样，考虑实际生产的效益，选择提取时间2h、3h、4h作为正交试验的3个水平。

2.2 山莓茎皮正交试验各处理的总黄酮含量

对山莓茎皮总黄酮提取的正交试验结果（表3）进行极差分析（表4）可知，极差RA＞RC＞RB＞RD，4个因素对山莓茎皮中总黄酮提取率的影响大小依次为乙醇浓度（A）＞回流温度（C）＞料液比（B）＞提取时间（D）。4个因素中，乙醇浓度和回流温度的影响作用最显著，其次是料液比，影响最小的是提取时间。根据4 个因素的k1、k2和k3值大小可知，A因素A1＞A2＞A3，B因素B1＞B2＞B3，C因素C3＞C1＞C2，D 因素D3＞D2＞D1。因此，乙醇回流提取山莓茎皮总黄酮的最佳工艺条件为A1B1C3D3，即乙醇浓度60%、料液比1∶30、回流温度80℃、提取时间4h，经验证试验得总黄酮提取量为28.811 mg／g。

表2 不同乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间的山莓茎皮总黄酮含量Table 2 Total flavonoids extracted fromR.corchorifolius stem barks with various ethanol concentration，solid－liquid ratio，extraction temperature and time

表3 山莓茎皮L9（34）正交试验各处理的总黄酮含量Table 3 Total flavonoids contents of different L9（34）orthogonal test treatments of R.corchorifolius stem barks

表4 山莓茎皮正交试验各因素水平总黄酮含量的均值与极差Table 4 The average and range of total flavonoids in the stem bark of R.corchorifolius at different conditions

图示山莓茎皮黄酮和BHT不同浓度对ABTS和DPPH 自由基的清除率Fig.ABTS and DPPH free radical－savenging rates of flavonoids from the bark of R.corchorifolius and BHT

2.3 山莓茎皮黄酮清除ABTS和DPPH自由基的能力

BHT 是人工合成的抗氧化剂，具有提高产品稳定性和保持品质等效果，但是有对人体造成潜在伤害的弊端[20]。由图示可见，山莓茎皮黄酮的提取液对ABTS和DPPH 自由基具有明显的清除效果，清除能力比BHT 高，且随着质量浓度的增加，清除率也随着增大，但增加到一定的质量浓度时，清除率增大幅度趋于平缓。在黄酮、BHT 抗氧化剂的质量浓度较低时，2种溶液对ABTS和DPPH 自由基的清除率（y）与质量浓度（x）之间呈近似线性关系（表5）。可见，山莓茎皮黄酮的提取液具较强的抗氧化性，山莓黄酮提取液对ABTS和DPPH 自由基清除率达50%时，IC50值均低于合成抗氧化剂BHT 的IC50值，因此有望成为一种天然抗氧化剂。