Interceed对宫腔粘连兔子宫内膜容受性的影响

李慧娟，何援利，胡海燕，李竞雄，王显，陈思萍，张冬梅

论 著

Interceed对宫腔粘连兔子宫内膜容受性的影响

李慧娟，何援利，胡海燕，李竞雄，王显，陈思萍，张冬梅

目的 探讨氧化再生纤维素防粘连膜(Interceed)治疗新西兰大白兔宫腔粘连(IUA)的有效性及其对子宫内膜容受性的影响。方法 将48只雌兔随机分为4组(每组12只)：正常对照组(A)、Interceed对照组(B)、模型未治疗组(C)、Interceed治疗组(D)。A组行假手术，不造模；B组：正常兔子宫内放置Interceed；C和D组均采用机械和感染双重损伤法构建IUA动物模型，C组不进行治疗，D组建模后7d宫腔内放置Interceed。各组于28d各处死4只动物，收集双侧子宫组织，行HE和Masson染色检测子宫内膜腺体计数和纤维化面积。每组剩余的8只兔于动情期刺激阴道排卵，于假孕第7天处死，取子宫组织，扫描电镜观察子宫内膜胞饮突的表达，免疫组化检测子宫内膜中整合素αVβ3蛋白水平。结果 与C组比较，D组子宫内膜腺体表达及纤维化程度均明显改善(P<0.05)，但A、B、D组两两比较差异均无统计学意义。A组子宫内膜表面有大量发育完全的胞饮突；B组胞饮突表达与A组相似；C组胞饮突分布稀少，发育不同步；D组胞饮突分布较C组增多，形态欠规则，发育同步。C组子宫内膜整合素αVβ3蛋白表达明显低于A组(P<0.05)；D组整合素αVβ3蛋白表达较C组明显增高(P<0.05)。结论 Interceed可一定程度逆转IUA的病理改变，增加子宫内膜整合素αVβ3蛋白的表达，并改善胞饮突的表达和发育，从而改善子宫内膜的容受性。

宫腔粘连；氧化再生纤维素防粘连膜；胞饮突；整合素αVβ3

宫腔粘连(intrauterine adhesion，IUA)是指由于手术、刮宫、电灼和药物腐蚀等原因致子宫内膜基底层损伤，引起子宫内膜瘢痕修复，从而导致宫腔肌壁和(或)宫颈管的全部或部分闭锁[1]。宫腔镜检查及镜下宫腔粘连分离术(transcervical resection of adhesions，TCRA)是目前诊疗的金标准[2]，针对TCRA术后粘连复发率高的问题，多数学者倾向于采取以屏障治疗为主的综合治疗，如放置宫内节育器+雌激素、放置小儿球囊导尿管、宫腔注射透明质酸胶体、羊膜移植、干细胞治疗等。也有学者应用防粘连材料，可在一定程度上改善患者的月经症状，但仍存在一定的局限性，妊娠率远远达不到令人满意的程度[3]。本课题组前期已成功将Interceed包绕宫内节育器并联合大剂量雌激素用于IUA分离术后，其防粘连效果显著，但由于观察时间短，大部分患者仍在治疗中，其妊娠率未见明显差异[4]。本研究以此为出发点，探讨Interceed治疗兔IUA的有效性及其对子宫内膜胞饮突和整合素αVβ3的影响，以期为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 细菌脂多糖(LPS)为Sigma公司产品；Masson染色试剂盒购自凯基公司；乌拉坦购自美国Amresco公司；多聚甲醛购自武汉博士德公司；Interceed防粘连膜购自美国强生公司；整合素αVβ3多克隆抗体为BioLegend公司产品；生物显微镜为日本奥林巴斯公司产品；S-3000N扫描电镜为日本日立公司产品。

1.2 实验动物分组及处理 健康成年雌性未孕普通级新西兰大白兔48只，体重3000～4000g，由南方医科大学动物实验中心提供[实验动物许可证号：SCXK(粤)2011-0015]。将48只兔随机分为4 组(n=12)：正常对照组(A组)、Interceed对照组(B 组)、模型未治疗组(C组)、Interceed治疗组(D组)。A组：行假手术，不造模。B组：在正常兔子宫中下1/3处做0.5cm纵切口，用1号无菌手术线将长约5.0cm、宽1.0cm的Interceed引入宫腔。C组和D组均采用机械和感染双重损伤法构建IUA动物模型，具体操作按照课题组前期研究方法[5]进行。C组：建模后不治疗。D组：建模后7d开腹，于子宫原切口处行0.5cm纵切口，用1号无菌手术线将长约5.0cm、宽1.0cm的Interceed引入宫腔。28d后各组分别处死4只动物，观察子宫形态变化，取双侧子宫组织，行HE染色观察子宫内膜形态学变化并进行腺体计数，Masson染色检测子宫内膜纤维化程度。各组各剩余8只兔，在其动情期用消毒过的涂有甘油的圆滑玻璃棒刺激阴道，诱发排卵，构建兔假孕模型，于假孕第7天处死，迅速剖腹取出子宫，扫描电镜观察胞饮突的表达，免疫组化法检测子宫内膜中整合素αVβ3蛋白的水平。

1.3 子宫内膜腺体数量和纤维化程度检测 各组28d后取子宫组织，经4%甲醛溶液固定24～48h后，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，行HE和Masson染色。每张HE染色切片选取5个高倍镜视野，计数每个视野下腺体数量，取其平均值。Masson染色下子宫内膜间质胶原纤维染成蓝色，呈梭形，排列整齐。每张Masson染色切片选取5个视野，用Imagepro Plus 6.0软件分析每个视野子宫内膜间质纤维化的面积及子宫内膜间质和腺体总面积。纤维化面积百分比为每个视野子宫内膜间质纤维化的面积除以子宫内膜间质和腺体的总面积，取平均值。

1.4 胞饮突的观察 各组假孕第7天处死，留取子宫组织，纵行剖开，固定于2.5%戊二醛溶液中，固定后的标本用PBS彻底冲洗，系列乙醇脱水，置于2%乙酸异戊酯中3h，临界点干燥、样本粘贴、涂银胶、喷金，扫描电镜观察胞饮突的表达。根据Nikas等[6]的标准将胞饮突按发育程度分为发育中、完全发育及退化3类。发育中的胞饮突特征形态为光滑、薄弱的质膜突起，呈现在整个细胞顶端；发育完全的胞饮突呈现出“菜花样”肿胀的质膜状突起，一般认为其出现标志着子宫内膜的最佳容受期；退化的胞饮突开始出现皱褶、塌陷，部分逐渐被微绒毛取代。按分布情况分为丰富(>50%)、适中(20%～50%)和微量(<20%)3个层次。

1.5 整合素αVβ3的免疫组化染色 各组假孕第7天处死动物留取子宫组织，经4%甲醛溶液固定24～48h后，常规脱水、石蜡包埋，4μm厚连续切片，行免疫组化染色检测子宫内膜中整合素αVβ3的表达。子宫内膜组织内呈现棕黄色颗粒为阳性信号，每张切片在光镜下随机取5个高倍镜视野，经Image Pro Plus 6.0病理图像分析系统分析，测定阳性信号的平均光密度值(MOD)，取其平均值。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。数据以±s表示，进行方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用多重比较LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 子宫组织形态学观察 A组子宫外观呈粉红色，内膜区呈灰白色，可见腺体开口，HE染色可见黏膜层、黏膜下层、肌层、浆膜层，黏膜层为单层柱状上皮细胞，黏膜下层为丰富的腺体、血管和少量排列整齐的成纤维细胞；B组放置Interceed 第28天子宫组织形态与A组相似，宫腔内未观察到Interceed残留，HE染色未观察到明显炎症反应；C组可见子宫粗细不均且轻度积水，HE染色见单层柱状上皮细胞消失，由扁平上皮细胞或低柱状上皮细胞覆盖，损伤严重区上皮缺失，黏膜下腺体极少，纤维化增生明显，排列紊乱；D组Interceed治疗后28d子宫解剖学结构基本恢复正常，HE染色下见柱状上皮细胞再生，腺体不同程度增多(图1、2)。

2.2 子宫内膜腺体数量比较 A、B、D组子宫内膜腺体数量两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)，但均明显高于C组(P<0.05，表1)。

图1 各组新西兰大白兔子宫大体观察Fig.1 The uterus of New Zealand white rabbit in each group

图2 各组兔子宫内膜HE染色结果(×400)Fig.2 HE staining of endometrium in each group (×400)

表1 各组子宫内膜腺体数量及纤维化面积比较(±s，n=8)Tab.1 Number of glands and the area of fibrosis in endometrium in each group (±s, n=8)

表1 各组子宫内膜腺体数量及纤维化面积比较(±s，n=8)Tab.1 Number of glands and the area of fibrosis in endometrium in each group (±s, n=8)

(1)P<0.05 compared with group C

?

2.3 子宫内膜纤维化面积比率的比较 Masson染色显示，A组子宫内膜间质表达少量胶原纤维，染成蓝色，呈梭形，排列整齐；B组胶原纤维的表达与A组相似，排列较整齐；C组间质层纤维组织增多，胶原聚集致密且排列紊乱；D组治疗后胶原纤维明显比C组减少，稀疏且排列整齐(图3)。4组间子宫内膜纤维化面积百分比比较差异有统计学意义(P<0.01)。A组、B组和D组子宫内膜纤维化面积百分比均明显低于C组(P<0.05)，而A、B、D组间两两比较差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

2.4 子宫内膜胞饮突的表达 扫描电镜观察结果显示，A组子宫内膜均匀分布大量膜状突起，大小一致，边界清楚，胞饮突表面因微绒毛的消失而变得光滑，呈蘑菇样外观，即完全发育的胞饮突；B组胞饮突丰富，大小不一致，边界清楚，偶有短而细的微绒毛，为完全发育的胞饮突；C组胞饮突表达被抑制，分布明显稀少，发育不同步，呈局灶性生长，部分为完全发育的胞饮突，部分为开始衰退的胞饮突；D组胞饮突较C组增多，形态欠规则，边界清楚，大多为完全发育的胞饮突，极少数为开始衰退的胞饮突(图4)。

图3 各组兔子宫内膜Masson染色结果(×400)Fig.3 Masson staining of endometrium in each group (×400)

2.5 整合素αVβ3蛋白在子宫内膜中的表达 整合素αVβ3蛋白表达于子宫内膜腔上皮、腺上皮细胞的细胞膜及胞质中，呈棕黄色颗粒状(图5)。与A组(0.36±0.05)比较，B组子宫内膜整合素αVβ3蛋白的表达(0.33±0.04)无明显变化，而C组和D组(分别为0.17±0.05、0.26±0.04)的表达则明显降低(P<0.05)，且C组的表达明显低于D组(P<0.05)。

图4 各组兔子宫内膜胞饮突的表达(×2000)Fig.4 Expression of pinopodes in rabbit endometrium in each group (×2000)

图5 整合素αVβ3蛋白在各组兔子宫内膜的表达(免疫组化 ×400)Fig.5 Expression of integrin αVβ3 in endometrium in each group (Immunohistochemistry ×400)

3 讨 论

创伤和感染等可引起子宫内膜基底层破坏、间质裸露、成纤维细胞和结缔组织增生，促进子宫内膜纤维化，从而形成IUA[7-8]，IUA可致月经量过少、闭经、继发性不孕、周期性下腹痛及严重产科并发症(如流产、早产、胎盘粘连、前置胎盘、胎盘植入和产后出血)[9]等。本研究采用机械和感染双重损伤法构建的兔IUA模型中肉眼可见的宫腔粘连带较少，但结果显示建模后子宫内膜腺体数量减少，纤维化面积增加，与本课题组前期研究结果一致[5]，这些病理改变均符合IUA的临床病理特征[10]，故该方法可以构建较为稳定的新西兰大白兔IUA模型，并可通过此模型评价Interceed治疗兔IUA的有效性及其对子宫内膜容受性的影响。

Interceed是一种氧化再生纤维素防粘连膜，是经氧化氮处理的可吸收人造纤维织物，具有生物相容性好、可降解、无毒、安全有效等优点，其用于盆腹腔术后防粘连效果十分明确，但用于预防IUA的研究较少。Gago等[11]通过一项体外培养研究发现Interceed对间皮细胞和成纤维细胞的形态和生长情况无明显影响，但能使间皮细胞组织型纤溶酶原激活物(tPA)mRNA的表达升高25%，而纤溶酶原激活物抑制物(PAI)mRNA的表达并未发生变化，因此tPA/PAI的比值升高，从而激活纤溶活性，薄弱的纤维蛋白粘连会被纤溶系统局部释放的蛋白酶所降解。Bicer等[12]在一项兔心包防粘连的动物研究中也发现术后3周和6周Interceed组的纤维增生明显少于对照组。本课题组前期研究未观察Intrceed治疗IUA后的病理变化，而且由于临床治疗周期长，随访时间短，尚未观察到妊娠率存在差异[4]。本研究结果显示，Interceed治疗组(D组)子宫内膜腺体数量和纤维化程度与模型未治疗组(C组)比较均明显改善，Interceed对照组(B组)子宫内膜腺体数量和纤维化程度与正常对照组比较差异均无统计学意义，说明Interceed对IUA有一定的治疗作用，且无明显不良反应。考虑其机制可能为：①保护膜机制；②Interceed具有影响巨噬细胞功能从而改变炎症反应状态的作用[13]；③Interceed可通过激活纤溶活性而释放蛋白酶，降解纤维粘连蛋白[11]。

IUA发生的根本原因是子宫内膜基底层损坏。韩燕华等[14]的研究结果提示IUA患者子宫内膜整合素αVβ3表达异常，可能降低子宫内膜容受性，影响囊胚着床，从而引发不孕或流产。胞饮突是在扫描电镜下所见宫腔被覆上皮细胞膜顶端出现的光滑膜性足状或蘑菇状突出物，在啮齿类动物、兔、牛等以及人的子宫内膜上都可见。胞饮突的作用主要是有利于囊胚定位附着，与囊胚着床的启动有关。完全发育的胞饮突是子宫内膜容受性建立和植入窗开放的重要形态学标志[15]。整合素αVβ3在胚胎植入过程中介导胚胎滋养层细胞与子宫内膜上皮细胞之间的相互作用，被公认为是子宫内膜容受性的标记分子之一[16]。在植入窗期，整合素αVβ3与胞饮突同步出现。本研究结果显示，Interceed对照组(B组)子宫内膜胞饮突及整合素αVβ3蛋白表达与正常对照组(A组)相似。模型未治疗组(C组)子宫内膜胞饮突分布明显稀少，呈局灶性生长，发育不同步，整合素αVβ3蛋白表达明显低于正常对照组。Interceed治疗组(D组)胞饮突及整合素αVβ3蛋白表达较模型未治疗组(C组)明显改善，但胞饮突表达仍不同步且形态欠规则，整合素αVβ3蛋白表达也低于正常对照组。说明Interceed治疗IUA后子宫内膜容受性有所改善，但仍达不到正常水平。

相关研究表明，Interceed在有血液和腹膜液存在时，其有效性受到一定限制[17]。因此，本研究在实验过程中特别注意到了以下两点：①将Interceed置入兔宫腔时应注意与子宫腔要有相对活动度，以免在置入过程中过紧引起宫腔内出血或子宫水肿而影响Interceed的有效性，但又不宜太松，即做到轻拉时能移动，不拉时不移动，保证足够量的Interceed存在于宫腔内；②Interceed使用后如果变黑应弃用，充分止血后置入新的Interceed，必要时用生理盐水冲洗宫腔。

综上所述，本研究结果表明，Interceed可一定程度逆转IUA兔子宫内膜的病理变化。采用机械和感染双重损伤法构建的兔IUA模型的子宫内膜容受性明显降低，Interceed可在一定程度上改善子宫内膜整合素αVβ3蛋白的表达和胞饮突的发育，从而提高IUA兔子宫内膜的容受性。若在治疗的同时加用一些提高子宫内膜容受性的药物可能会达到更好的效果。不是之处在于本研究只观察了Interceed治疗IUA的有效性及其对IUA子宫内膜容受性的影响，未进行雌雄交配观察其妊娠结局，其对妊娠结局的影响尚有待进一步研究。

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Effects of Interceed on endometrial receptivity in rabbits with intrauterine adhesion

LI Hui-juan, HE Yuan-li*, HU Hai-yan, LI Jing-xiong, WANG Xian, CHEN Si-ping, ZHANG Dong-mei
Department of Obstetrics and Gynecology, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, China
*

, E-mail: heyuanli310@163.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81270658)

ObjectiveTo observe the effect of anti-adhesion membrane made of oxidized regenerated cellulose (Interceed) on endometrial receptivity in New Zealand white rabbits with intrauterine adhesion (IUA).MethodsForty-eight female rabbits were randomly divided into 4 groups (12 each): normal control group (group A), Interceed control group (group B), untreated model group (group C), and Interceed therapy group (group D). Rabbits in group A

sham operation and underwent no modeling. The Interceed was placed into the normal rabbits' uteruses in group B. The IUA rabbit models were reproduced in group C and group D by both mechanical injury and infection. Rabbits in group C were not treated, and in group D Interceed was put into their uteruses 7 days after modeling. Four rabbits in each group were sacrificed on the 28th day, the uterine tissues were collected. The endometrial glands count was performed after HE staining, and the degree of endometrial fibrosis was assessed after Masson staining. For the remaining animals in each group, ovulation was induced by stimulating the vagina in estrus, and they were sacrificed and the uterine tissue was collected on the 7th day after pseudopregnancy. The expression of pinopodes in endometrium was observed by scanning electron microscopy, and that of integrin αvβ3 protein was determined by immunohistochemistry.ResultsThe expression of glands and the degree of fibrosis in endometrium was obviously improved in group D as compared with that of group C (P<0.05), but no significant difference was found among the groups A, B and D. In group A, and developed pinopodes were abundantly expressed in endometrial surface, and similar changes were found in group B. The expression of pinopodes in group C was scarce, and the development was not synchronized. More pinopodes, with irregular shape and synchronized development, were expressed in group D than in group C. The expression of integrin αvβ3 protein was significantly lower in group C than in group A and group D (P<0.05).ConclusionInterceed may alleviate the endometrial pathological changes, increase the expression of integrin αVβ3 protein, ameliorate the expression and development of pinopodes, thus improve the endometrial receptivity.

intrauterine adhesions; interceed; pinopodes; integrin alphaVbeta3

R711.32

A

0577-7402(2015)05-0344-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.05.02

2014-12-05；

2015-01-29)

(责任编辑：张小利)

国家自然科学基金(81270658)

李慧娟，硕士研究生。主要从事女性不孕症及宫腔粘连的基础与临床研究

510282 广州 南方医科大学珠江医院妇产科(李慧娟、何援利、胡海燕、李竞雄、王显、陈思萍、张冬梅)

何援利，E-mail：heyuanli310@163.com