桂竹糖芥苷对大鼠肾髓袢升支粗段管周膜50 pS钾通道活性的调控机制①

隋洪玉，齐淑芳，贾秀月，王 毅

(1.佳木斯大学生理教研室，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

桂竹糖芥苷对大鼠肾髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道活性的调控机制①

隋洪玉1，齐淑芳1，贾秀月1，王 毅2

(1.佳木斯大学生理教研室，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：探讨桂竹糖芥苷对肾髓袢升支粗段(thickascendinglimb,TAL)管周膜50pS钾通道活性的调控机制。方法：采用细胞贴附式膜片钳技术及免疫印迹技术测定桂竹糖芥苷对50pS钾通道活性的调控机制。结果：桂竹糖芥苷可明显抑制50pS钾通道的活性(P<0.01)；PKC阻断剂存在时，桂竹糖芥苷不再增加50pS钾通道的活性(P>0.05)。结论：桂竹糖芥苷可能是通过激活PKC依赖途径抑制50pS钾通道活性的。

桂竹糖芥苷；髓袢升支粗段；钾通道；PKC

桂竹糖芥主要分布在我国东北地区，为十字花科糖芥属二年生草本植物，野生资源丰富，又名小花糖芥，其主要成分为糖芥强心苷(简称桂竹糖芥苷，erysimosides)，具有利尿、强心、抗心律失常等作用[1]。本实验研究拟观察桂竹糖芥苷对肾髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道活性的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

体重为70～90gSD大鼠，雌雄均可，购于哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心。

1.2 药品、试剂及药材

CollagenaseA、actin、p-PKC、PKC(SantaCruz公司)；预染Marker(Fermentas公司)；ECL显影液(Pierece公司)；桂竹糖芥(佳木斯市药材中心)。

1.3 桂竹糖芥苷的提取

120g糖芥种子经80%乙醇回流提取4次，前两次为2小时/次，后两次为1小时/次，共得80mL合并滤液，在其中加入80mL正己烷萃取4次。过滤萃取液，得80mL液体，上10gMCI层析柱，然后分别用水和不同比例的甲醇(10%、20%、30%、40%、60%、80%、100%)洗脱分离[2]。并收集60%甲醇处的强心苷用于实验[3]。

1.4TAL组织的制备

对实验用SD大鼠进行颈关节脱位后，立即打开腹腔取出双肾，剥除被膜，做薄的冠状切片，而后将肾片置于含有胶原酶的溶液中，于37℃水浴锅内孵育45～60min。在体视显微镜下，分离出肾髓袢升支粗段(TAL)并固定在载玻片上备用。

1.5 膜片钳单通道记录技术

用膜片钳放大器记录到50pS钾通道电流后进行滤波及数字化处理，储存并分析相关数据资料。通道活动度用NPo表示，为通道开放数与通道开放频率的乘积，NPo=Σ(1t1+2t2+…… +iti)。

1.6 统计学方法

采用均数±标准差表示。实验中各项指标均采用自身配对t检验，以P<0.05作为差异显著性指标。

2 结果

2.1 桂竹糖芥苷对肾髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道活性的影响

桂竹糖芥苷(1μmol/L)可明显抑制50pS钾通道的活性，加药前NPo为0.28±0.07，加药后NPo为0.03±0.01，(n=3，P<0.01)。见图1。

图1 桂竹糖芥苷对肾髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道活性的影响

2.2PKC阻断剂存在时，桂竹糖芥苷对大鼠髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道的影响

PKC阻断剂(CalphostinC)存在时，桂竹糖芥苷不再抑制50pS钾通道的活性，加药前NPo为0.39±0.12，加药后NPo为0.34±0.11，(n=3，P>0.05)。见图2。

图2CalphostinC存在时，桂竹糖芥苷对髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道的影响

3 讨论

肾脏是机体最重要的排泄器官，在调节机体水盐平衡及酸碱平衡中发挥重要作用，而肾髓袢升支粗段是肾小管的一部分，其生理功能主要表现在两方面：一方面，它可以重吸收超滤液中20%～30%的Na+、Cl-、K+等物质，即具有重吸收功能；另一方面，通过对Na+和Cl-等物质的重吸收，使其成为肾髓质渗透梯度形成的重要部位，因而在尿液的浓缩和稀释过程中发挥重要作用。大量研究发现，在髓袢升支粗段的管腔膜和管周膜上都存在着多种钾通

道并发挥重要作用，其管周膜上钾通道的主要作用是将细胞内K+转运至组织间液，使细胞内K+浓度降低而促进K+的再循环，进而使管周膜超极化，加快Cl-的转运，使细胞内Cl-浓度进一步降低，因此，可间接促进Na+-K+-2Cl-同向转运体的转运。利用膜片钳单通道记录技术发现，50pS钾通道是TAL管周膜上的主要钾通道，多种物质均可调节其活性，如ATP、花生四烯酸、腺苷、Ca2+等[4，5]。桂竹糖芥苷具有强心、利尿的作用，且发现其利尿作用可能与TAL管周膜50pS钾通道活性有关[6]，但其对50pS钾通道的调控机制尚不清楚。通过本实验研究证实桂竹糖芥苷可明显抑制50pS钾通道的活性，且可能是通过激活PKC依赖途径实现的。

[1]石秀梅，李孟全，高雪玲，等.桂竹糖芥中强心甙的种类及丰度研究[J]．牡丹江医学院学报，2004，25(3)：39-40

[2]李孟全，王秋娟，关利新.桂竹糖芥苷对血管平滑肌细胞增殖的影响[J].中国天然药物，2007，5(5)：370-373

[3]LeiZH,JinZX,MaYL,etal.CardiacglycosidesfromErysimumCheiranthoide[J].Phytochemistry, 1998, 49(6): 1801-1803

[4]隋洪玉，孙玉鸿，李莹.腺苷类似物CHA对大鼠肾脏髓袢升支粗段中PKA及PLA2蛋白表达的影响[J].黑龙江医药科学，2011，34(4)：23-24

[5]HongyuS,HaiyanL,YujieL.InvolvementofproteinkinaseAactivationandphospholipaseA2inhibitionintheadenosine-activatedbasolateral50pSK+channelsinthethickascendinglimboftheratkidney[J].ActaPhysiologicaSinica, 2012, 64(4): 449-454

[6]隋洪玉，赵晓莲，齐淑芳,等.桂竹糖芥苷.肾小管功能及髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道活性的影响[J].黑龙江医药科学，2013，36(3)：36-37

The regulatory mechanism of erysimosides on the basolateral 50 pS potassium channel in the thick ascending limb

SUIHong-yu1,QIShu-fang1,JIAXiu-yue1,WANGYi2

(1.Department of Physiology in the Jiamusi University,Jiamusi 154007,China;2．First Affiliated Hospital in the Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Objective: To study the regulatory mechanism of erysimosides on the 50 pS potassium channel in the thick ascending limb (TAL) of rat kidney. Methods: The patch-clamp cell-attached recording technique was used to record the single potassium channel current. The western blot technique was used to detect the protein express of phosphate-PKC. Results: Erysimosides can decrease the 50 pS potassium channel activity of TAL, and PKC inhibitor can inhibit the effect. Conclusion: Erysimosides can inhibit the activity of basolateral 50 pS potassium channel by the PKC-dependent pathway.

erysimosides; thick ascending limb; potassium channels; protein kinase C

黑龙江省卫生厅科研项目，编号：2012-250；佳木斯大学青年基金资助课题，编号：Sq2012-36。

隋洪玉(1976～)女，黑龙江佳木斯人，博士，副教授。

王毅(1971～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，副教授。E-mail:wangyijms@126.com。

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A

1008-0104(2015)02-0038-02

2014-01-06)