铜胁迫对双穗雀稗生理特性及铜积累的影响

张 静 梁克中 陈秀红 余顺慧 祁俊生

（重庆三峡学院，三峡库区水环境演变与污染防治重庆高校市级重点实验室，重庆万州 404100）

铜胁迫对双穗雀稗生理特性及铜积累的影响

张 静 梁克中 陈秀红 余顺慧 祁俊生*

（重庆三峡学院，三峡库区水环境演变与污染防治重庆高校市级重点实验室，重庆万州 404100）

本研究探索铜胁迫对双穗雀稗（Paspalum Distichum L.）的毒害机制，为铜污染水体植物修复提供理论依据．阐明了三峡库区消落带适生植物双穗雀稗在不同浓度Cu2+作用下新芽数、叶绿素含量、抗氧化酶系统超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性及重金属铜累积与分布的影响．结果表明：在0～40 mg/L Cu2+浓度处理范围内，Cu2+浓度在0～10 mg/L时对双穗雀稗抗氧化酶系统和叶绿素含量及新芽数均有促进作用；但随着Cu2+浓度的不断增大，双穗雀稗抗氧化酶系统活性明显下降，Cu2+浓度增加到一定程度后，POD活性又稍微上升．当Cu2+浓度＞10 mg/L时，双穗雀稗的新芽数和叶绿素含量减少．双穗雀稗主要通过根、茎积累Cu2+，且表现为积累量根＞茎；双穗雀稗可以有效降低水体、土壤中Cu2+的含量，在三峡库区消落带库岸植物修复中具有潜在应用价值．

铜胁迫；双穗雀稗；生理特性；铜积累

1 引 言

铜是植物必需微量营养元素，参与植物的光合作用以及呼吸作用，并且与叶绿素的形成有关，同时也是环境污染重金属元素．由于三峡库区工矿企业等的发展及农用化肥大规模的使用，许多重金属铜进入库区消落带，加快其循环，通过生物放大严重影响人们的健康．所以，目前研究的热点之一是如何去除三峡库区消落带水体及土壤中重金属．总结前人研究，发现植物修复具有许多优点，但它的难点在于超积累植物的筛选及应用[1]．目前已知的超积累植物大多具有入侵性，具有一定的生态风险．而双穗雀稗不是超积累植物，适合生长在消落带，是消落带库岸植被修复与重建的优良物种之一[1-3]．之前，大量研究者尽管在植物耐重金属方面做了相当多的研究，比如：本实验室做了狗牙根修复铜及铅污染土壤和水体方面的研究，并且取得了一定的进展[4-7]．但就双穗雀稗对铜污染的土壤、水体修复及铜积累特性的研究相对比较匮乏．为此，以双穗雀稗为研究材料，通过水培实验，研究了不同浓度梯度铜胁迫条件下对双穗雀稗植物新芽数、叶绿素含量、抗氧化酶系统及重金属铜累积与分布的影响，以期为消落带植被重建过程中物种的筛选、环境修复技术提供一定的科学理论依据．

2 材料与方法

2.1 材 料

2.1.1 供试材料 双穗雀稗：于2014年4月采于重庆市万州区牌楼消落带．

2.1.2 试剂 CuSO4•5H2O（AR），Hoagland营养液（使用AR药品配制而成）．

2.1.3 仪器 TDZ5-WS多管架自动平衡离心机（赛特湘仪器有限公司）、MARS240微波消解系统（美国CEM公司）、紫外分光光度计（T6新世纪）、AA-6300原子吸收分光光度计（日本岛津公司）．

2.2 实验方案设计

共设5个不同铜浓度，分别为：0 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L，40 mg/L，以模拟Cu2+污染环境．每组设3个平行实验．

2.3 实验方法

2.3.1 材料预处理 植物采回后，选取生物量大约相同的幼苗移栽到实验室土壤中培养直至长出新芽．将长出新芽的植株用自来水、去离子水冲洗至去离子水中检测不出Cu2+后，将其放于装有65 mL的Hoagland营养液的广口瓶中纯化水培培养．待植株长出新根后，将上述植株放入加有不同浓度（铜以CuSO4•5H2O形式加入）的营养液中胁迫处理．实验过程中需保证24 h连续通气，白天将其移到室外保证其充分光照．随时补充液体，每五天更换一次营养液．为了避免营养液产生沉淀，KH2PO4浓度降低为0.005 mmol/L．实验过程中每24小时查看一次植株生长状况，处理8天后立即收获植株及时测定其相应的指标．

2.3.2 生理指标的测定 采用“南京建成生物工程研究所”购买的SOD、POD试剂盒测定SOD、POD的活性．分别用分光光度法[8]、丙酮—乙醇分光光度法[9]，测定CAT活性以及叶绿素含量．

2.3.3 铜含量的测定 用去离子水洗净处理8天后收获的双穗雀稗，将其根、茎分离，在鼓风干燥箱中烘干（80oC）处理待用．称取一定质量放入磨砂研钵内研磨至均匀的粉末，精确称取0.200 0 g供试样品于消解罐中，加入混酸（浓H2SO4︰浓HNO3= 1︰4）．将其消解冷却后过滤，定容至25 mL容量瓶中保存待测，用AA-6300原子吸收分光光度计测定样品Cu2+含量，单位为mg/kg干重．同时做空白组．

2.4 数据处理

实验数据处理、分析使用Origin8.0软件进行．

3 结果与分析

3.1 Cu2+胁迫对双穗雀稗生长的影响

由图1能够看出，双穗雀稗在外源Cu2+胁迫条件下，随着Cu2+浓度逐渐变化对双穗雀稗的生长有显著的影响，具体表现如下：外源Cu2+浓度在0～10 mg/L时，随着Cu2+浓度的增加，双穗雀稗的新芽数不断增加，10 mg/L时新发芽数达到峰值，可能是由于低浓度的Cu2+在一定程度上促进双穗雀稗的生长，导致新芽数比空白组的增加；外源Cu2+胁迫浓度从10～40 mg/L增加时，随着培养时间的增加，双穗雀稗的新芽数呈现出明显的下降趋势，甚至在40 mg/L时双穗雀稗的新芽数是零，说明了Cu2+在40 mg/L时对双穗雀稗的胁迫作用最大，症状最明显，第8天后死亡．表明低浓度Cu2+有利于双穗雀稗生长，浓度较高时反而不利于其生长．表现出伤害症状时，高浓度Cu2+处理的双穗雀稗植株生长比较迟缓，植株矮小，叶片逐渐失水干枯．（注：定时每天查看双穗雀稗生长状况以及症状表现．）

3.2 Cu2+胁迫对双穗雀稗叶绿素含量的影响

由图2知，双穗雀稗经Cu2+处理后，Cu2+浓度在0～10 mg/L时，双穗雀稗叶片叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a + b的含量逐渐上升，此时，叶绿素在Cu2+胁迫初期（0～10 mg/L时）表现出一定的抗逆性．随着Cu2+浓度的进一步增大（10～40 mg/L），色素含量呈现下降的趋势，故叶绿体结构破坏．原因可能是由于高浓度Cu2+进入植物体细胞内，导致细胞器叶绿体中的叶绿素加快分解，致使叶绿素蛋白中心离子组成发生变化而出现失活[11]．

3.3 Cu2+胁迫对双穗雀稗SOD、POD、CAT活性的影响

一起构成植物体内的抗氧化酶系统的是超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT），它们之间相互协调共同作用，可以有效清除植物细胞内的自由基等[5,6]．

3.3.1 对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

SOD是重要的自由基清除酶，以防御自由基对细胞产生毒害作用（如在重金属胁迫下，植物体内会产生大量的活性氧自由基，SOD能及时将其清除）．由图3可以看出，一定铜离子浓度范围内，随着外源铜浓度增加，双穗雀稗叶片的SOD酶活性显著升高，Cu2+浓度为10 mg/L时，SOD活性为最大；但随外源铜浓度的进一步升高（10～40 mg/L），SOD酶活性逐渐降低．这可能是由于Cu2+在双穗雀稗体内积累量超过一定临界值（10 mg/L）时导致双穗雀稗细胞内产生的活性氧自由基超过了保护酶系统的清除能力．这与周长芳等的研究结果相一致[14]．

图1 铜胁迫对双穗雀稗植株新芽数的影响Fig．1 Effects of Cu2+stress on new sprout number of P. Distichum

图2 Cu2+胁迫对双穗雀稗叶绿素含量的影响Fig2 Effects of Cu2+stress on chlorophyll content in leaves of P. Distichum

3.3.2 对过氧化物酶（POD）活性的影响

POD也是植物抗氧化系统中重要的自由基清除酶．POD清除自由基的原理是可以把SOD的歧化产物过氧化氢转化为水．逆境较严重时可诱使植物细胞内生成更多自由基，导致POD活性增强．所以，如果POD活性较高时，植物组织可能受到损害以及破坏的程度越严重．从图3可知，在一定浓度范围内，随着外源Cu2+浓度增加，双穗雀稗叶片的POD酶活性呈现出略微上升的趋势，在10 mg/L时达到最大；Cu2+浓度 > 10 mg/L时，POD活性缓慢下降，而后POD活性又增大．但POD活性随着外源铜离子浓度增加总体是呈上升趋势．前段上升的原因，可能是铜胁迫对双穗雀稗POD活性起到了诱导作用；下降原因，可能是随着外源铜浓度的增大，双穗雀稗超氧自由基的生成量较高，超出了POD酶清除超氧自由基的能力，导致植物体内自由基的清除与产生失衡；后期POD活性上升，可能是由于植株衰老引起．这与余顺慧等的研究所得结论相同[6]．

3.3.3 对过氧化氢酶（CAT）活性的影响

CAT酶是促使过氧化氢分解成分子氧和水的生物催化剂，因此能够清除植物细胞内的过氧化氢，从而让植物细胞避免被过氧化氢毒害[6]．由图3可以看出，在一定铜浓度范围内，随着外源Cu2+浓度增加，双穗雀稗叶片的CAT酶活性先升后降，上升的原因可能是植物在低浓度的Cu2+胁迫下，其叶片内随着SOD活性升高，歧化反应产生的过氧化氢增多，导致CAT酶底物浓度增加所致；下降的原因可能是由于在高浓度Cu2+作用下CAT活性表现出抑制作用，植株在长期受到高浓度重金属离子作用后，造成CAT酶分子内在结构发生了改变．这与余顺慧等的研究结果一致[6]．

图3 Cu2+胁迫对双穗雀稗SOD、POD、CAT活性的影响Fig3 Effects of Cu2+stress on activities of SOD、POD、CAT in leaves of P. Distichum

3.4 Cu2+胁迫对双穗雀稗积累铜及分布情况的影响

随着营养液中外源Cu2+浓度增大，双穗雀稗根和茎累积Cu2+的百分比显著增大（见表1）．当水体被重金属污染后，重金属利用水体—植物系统进入双穗雀稗细胞内，随着外源重金属的增加，导致双穗雀稗根、茎中重金属含量百分比显著增大，其迁移富集量表现为根 > 茎．由表1可知，跟空白组比较，在用不同的Cu2+胁迫处理后，双穗雀稗茎和根中Cu2+的质量百分比变化比较明显．因此可以推断，双穗雀稗主要通过根富集重金属离子．

表1 Cu2+在双穗雀稗植物体内的积累和分布情况(比例）Table1 Accumulation and distribution of Cu2+in P. Distichum

4 讨 论

铜是植物必需微量元素之一，影响着植物的生长发育[12]，通过研究，发现在一定浓度范围内Cu2+胁迫作用下，可以提高双穗雀稗的新芽数，促进其生长，但超出一定浓度范围后，双穗雀稗的新芽数降低，直至死亡．

叶绿素是植物进行光合作用生成有机物的重要色素，其含量将直接反映出植物光合作用能力的强弱，进而影响着植物的生长能力．低浓度的铜胁迫对叶绿素的形成有一定的促进作用，但超过一定浓度范围后，反而抑制叶绿素的形成[13]．

抗氧化酶系统的活性直接影响着植株细胞内氧化物、自由基等的代谢与清除．高活性抗氧化酶有利于提高植物对各种外界胁迫（生物及非生物）的耐受性[12]．通过本研究可以得出，低浓度铜处理草本植物双穗雀稗时SOD、POD、CAT活性均有增加，而高浓度铜处理则表现出一定的抑制作用，具体表现为：SOD和CAT降低，POD活性随着铜浓度的增加，逐渐升高，POD酶活性总体呈上升趋势．这可能是由于铜胁迫对双穗雀稗POD活性起到诱导作用，而且POD也可在逆境或衰老后期进行有效表达，并参与叶绿素的分解作用，表现为伤害效应．

在本研究中，随着外源Cu2+浓度增大，双穗雀稗茎和根累积铜离子的百分比明显增多，富集量表现为根 > 茎，这一结果与邱喜阳等的研究结果一致[2]．在本试验中，当外源铜浓度是40 mg/L时，植物虽然出现伤害症状，双穗雀稗地上及地下部分富集铜百分比仍然较高，分别是31.76%和68.24%，虽然这种草本植物不属于超富集植物，但考虑到双穗雀稗既耐水淹又耐干旱，而且生长迅速，生物量大，综上，双穗雀稗可用于铜污染水体、土壤修复．

5 结 论

（1）在低浓度铜处理时，双穗雀稗的新芽数、叶绿素含量、SOD活性、CAT活性、POD活性有一定促进作用，而高浓度的铜胁迫对植物的上述指标有抑制作用，其中POD活性表现出其特殊性，即总体趋势为上升．

（2）尽管双穗雀稗不是Cu2+的超积累植物，但是从其富集Cu2+的能力以及长期耐水淹等方面考虑，在使用生物修复技术治理Cu2+污染的环境中具有潜在应用价值，综合考虑，双穗雀稗能够作为三峡库区消落带环境（水体、土壤）修复的优良物种．

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[5]余顺慧，来守军，付川，等.铜胁迫对三峡库区消落带适生植物狗牙根生理特性和铜积累的影响[J].西南师范大学学报：自然科学版，2013，38（11）：64-69.

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[9]李合生.植物生理生化试验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，2000.

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（责任编辑：张新玲）

Effects of Cu2+Stress on Physiological Properties of Paspalum Distichum and Copper Accumulation

ZAHNG Jing LIANG Kezhong CEHN Xiuhong YU Shunhui QI Junsheng*
(Key Laboratory of Water Environment Evolution and Pollution Control in Three Gorges Reservior, Wanzhou, Chongqing, 404100, China)

This paper clarifies the poisoning mechanism of the copper stress on Paspalum distichum (Paspalum Distichum L.) to provide a theoretical basis for copper phytoremediation of polluted water body. In this hydroponic experiment, CuSO4.5H2O was added into Hoagland solution to simulate the Three Gorges Reservoir water pollution Cu2+. It clarifies the appropriate plants in Three Gorges Reservoir with a double spike paspalum at different concentrations, Cu2+effect sprout number, chlorophyll content, antioxidant enzyme superoxide dismutase system (SOD), peroxidase (POD), catalyse (CAT) activity and the cumulative effects and distribution of heavy metals copper. The results show that: in the 0 ~ 40mg L Cu2+inside / concentrations range, Cu2+concentration in the 0 ~ 10 mg / L when Paspalum distichum chlorophyll content and antioxidant enzyme systems and the number of new shoots are promoted; but with Cu2+concentration increases, Paspalum distichum decreases antioxidant enzyme system activity, Cu2+concentration increases to a certain extent, POD activity also increases slightly. When Cu2+concentration is > 10 mg / L, the number of shoots and chlorophyll content Paspalum distichum reduces. Paspalum distichum accumulates Cu2+mainly through the roots, stems, and the performance of the accumulation of roots is > stems; Paspalum distichum can effectively reduce the water level, Cu2+content in soil. It is of much potential value in Phytore remedy in the Three Gorges Reservoir of Yangtze River .

Cu2+stress;Paspalum Distichum; Physiological characteristics; Cu2+uptake

Q945.7

A

1009-8135（2015）03-0109-05

2015-02-06

张 静（1992-），男，重庆三峡学院在读硕士，主要研究环境科学.

祁俊生（1964-），男，重庆三峡学院教授，博士，主要研究环境科学.

重庆高校市级重点实验室开放基金项目“三峡库区水环境演变与污染防治”（WEPKL2012MS-01）阶段性成果