促进种子萌发的重楼内生菌的筛选

宋发军,于鹏飞,刘 佳,席晓圆,赵盛英,张 鹏

(中南民族大学 生命科学学院, 生物技术国家民委重点实验室/武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉 430074)

促进种子萌发的重楼内生菌的筛选

宋发军,于鹏飞,刘 佳,席晓圆,赵盛英,张 鹏*

(中南民族大学 生命科学学院, 生物技术国家民委重点实验室/武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉 430074)

通过比较60株重楼内生细菌发酵液的水相提取液和有机相提取液对冬小麦种子萌发的影响，发现8株细菌的有机相提取物具有促萌发作用.将其中4株细菌的发酵液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，蒸干物用甲醇溶解并稀释成不同浓度处理冬小麦种子.结果表明：肠杆菌属74#菌的石油醚相提取物、不动杆菌属108#菌的氯仿相提取物、芽孢杆菌属138#菌的氯仿相提取物和克雷白氏杆菌属149#菌的乙酸乙酯相提取物的促萌作用较强(p<0.05)；其中芽孢杆菌属138#菌的氯仿相提取物的1/2稀释液的促萌作用最强(p<0.01).

重楼内生菌；冬小麦种子；萌发；提取物

植物内生菌是一类多样性丰富的微生物类群，常生活在健康植物的各种组织和器官内部的细胞或细胞间隙内，一般不引发宿主植物明显感染.早在19世纪已分离得到内生菌[1,2]，但目前，内生菌的价值和作用并未获得深入的研究和应用[3,4].内生菌对植物的生长有重要影响，如感染内生菌的植物一般较未感染的植株生长更快，且人工接种某些内生菌还能提高植物存活率，促进发芽[1,2,5].

许多重要的药用经济植物具有显著的种子休眠特征，如重楼、圆柏种子等休眠时间长，从播种到出土成苗需要约2年，是典型的“2年种子”[6].通过筛选能促进种子萌发的内生菌，利用其打破药用植物种子的休眠，可为药用植物的快速繁育奠定基础.本文以冬小麦种子为对象，分离重楼内生菌的发酵液提取物并处理冬小麦种子，筛选可促进种子萌发的内生菌，并对菌株进行了初步分类鉴定，为获得可有效打破种子休眠、促进种子萌发的内生菌及其产物的研究提供了基础.

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

冬小麦种子、重楼内生菌由中南民族大学生命科学学院提供，甲醇、无水乙醇、氯仿等(国药集团化学试剂有限公司)，恒温培养箱、高压灭菌锅、旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂).

1.2 重楼内生菌的分离和发酵液提取物的制备

参照文献[7]，将重楼块茎削除外皮后， 用0.1%升汞溶液处理5 min，75%酒精处理5 min，灭菌水清洗后，在超净工作台上切成1 cm2左右的小块，接植在LB固体培养基平板上，室温培养7d.每日观察，将长出的细菌分别挑至新的LB固体培养基平板上纯化后进行保种.将分离的内生菌接种于100 mL LB培养基中，37 ℃、190 r/min摇床培养7d后，超声破碎10 min，5000 r/min离心15 min并收集上清液，即为发酵液[8].

1.3 促萌发内生菌的初筛

将发酵液用等体积氯仿萃取，分别得有机相和水相，用旋转蒸发仪分别蒸干水相和有机相.蒸干后水相固体用超纯水定容至30 mL，有机相固体用1.5 mL分析纯甲醇溶解，超纯水定容至30 mL备用[9].冬小麦种子经适量的灭菌水于37 ℃恒温浸种12 h后，均匀放置在铺有滤纸的培养皿中[10]，把不同内生菌发酵液提取物加到对应编号的培养皿中处理冬小麦种子，培养条件为：室温、暗培养.以含5%甲醇的超纯水处理做对照，并参照文献[8]，在第3, 5, 7 d观察和统计冬小麦种子的发芽率.

1.4 促萌发内生菌的复筛

将初筛获得的菌株的发酵液，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇(极性由小到大)进行萃取得有机相萃取液，蒸干后分别用1.5 mL甲醇溶解，超纯水定容至30 mL，分别得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取液原液，再用含5%甲醇的超纯水分别进行1/2、1/5梯度稀释.将提取液原液和稀释液依据1.3的方法处理冬小麦种子，以含5%甲醇的超纯水处理做对照.每个浓度的处理实验进行3个平行重复，并在第3, 5, 7 d观察并统计冬小麦种子的发芽率.

2 结果

本文从重楼块茎共分离、纯化获得60株形态有差异的细菌.将其发酵液提取物分别处理冬小麦种子，结果(见表1)表明：不同内生菌发酵液的水相提取物均不能促进冬小麦种子的萌发，甚至存在一定的抑制作用，故复筛时不再对水相提取物进行实验；而有机相提取物具有促进冬小麦种子萌发的能力，其中74#、108#、114#、136#、138#、139#、147#、149#菌株的有机相提取物具有较明显的促萌发作用(p<0.05)，在3, 5, 7 d检测点的萌发率明显高于其他菌株及对照处理(p<0.05).

表1 促进冬小麦种子萌发的内生菌的初筛结果

对初筛的8株菌进行了基因组DNA的提取和16S rDNA的扩增及测序分析，结果表明：74#、114#、139#菌株属于肠杆菌属(Enterobactersp.)，108#菌属于不动杆菌属(Acinetobactersp.)，136#、138#、147#菌属于芽孢杆菌(Bacillussp.)，149#菌属于克雷白氏杆菌属(Klebsiellasp.).

从4个菌属中各选取一株促萌效果最好的菌株：74#、108#、138#、149#进行复筛，结果(见表2)表明：74#菌落的石油醚相提取物(3, 7 d最大发芽率70%, 85%)，108#菌落的氯仿相提取物(3, 7 d最大发芽率71%, 83%)，138#菌落的氯仿相提取物(3, 7 d最大发芽率76%, 80%)，149#菌落的乙酸乙酯相提取物(3, 7 d最大发芽率62%, 86%)促萌发作用较强(p<0.05).各个有机相提取液的1/2稀释液比原液和1/5稀释液的促萌效果更好(p<0.05)： 3 d萌发率高出4%～38%； 5 d萌发率高出21%～29%； 7 d萌发率高出22%～28%.以3 d时的数据作为主要依据可见，138#菌株的氯仿相提取物的1/2稀释液的促萌发作用最强(p<0.01, 见图 1).

表 2 4株菌发酵液的4种有机相提取物对冬小麦种子萌发率的影响

注：PEE(petroleum ether extract):石油醚萃取物; CE(chloroform extract): 氯仿萃取物; EAE(ethyl acetate extract):乙酸乙酯萃取物; NBE(n-butanol extract): 正丁醇萃取物

-1：石油醚相提取液; -2：氯仿相提取液; -3：乙酸乙酯相提取液; -4：正丁醇相提取液**与CK(含5%甲醇的超纯水处理)相比, p<0.01图1 在3 d时 74#、108#、138#、149#菌株发酵液有机相提取物的1/2稀释液对冬小麦种子的促萌效果Fig. 1 The promotive effcet of the half dilution of the organic phase solution extracted from the fermentation broth of strain 74#、108#、138#、149# on the germination of winter wheat seeds on the third day

3 结论

(1) 通过比较60株菌发酵液水相提取物和有机相提取物的处理结果，发现不同内生菌发酵液的水相提取物均不能促进冬小麦种子的萌发，而有机相提取物对冬小麦种子萌发具有促进作用，推测促萌发物质居于有机相.

(2) 通过比较4株不同属细菌的发酵液的有机相提取物对冬小麦种子萌发的影响，发现不同属内生菌的有机相提取物的促萌发能力不同，肠杆菌属74#的石油醚提取物、不动杆菌属108#的氯仿提取物、芽孢杆菌属138#的氯仿提取物、克雷白氏杆菌属149#的乙酸乙酯提取物的促萌发作用较强.

(3) 通过比较3d时不同稀释度的提取液对冬小麦种子的促萌发作用，发现138#菌落的氯仿相提取物的1/2稀释液的促萌发作用最强.

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Screening ofPolyphyllaEndophytes with Germination Effect

SongFajun,YuPengfei,LiuJia,XiXiaoyuan,ZhaoShengying,ZhangPeng

(College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, National Committee Key Laboratory for Biotechnology/Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application Special Plant Germplasm in Wuling Area of China ,Wuhan 430074, China)

The effect of the aqueous and organic extracts of the fermentation broths of 60Polyphyllaendophytic bacteria on the germination of winter wheat were compared. The organic extracts of 8 endophytes had germination effect and four fermentation broths from them were then extracted by petroleum ether, chloroform, ethyl acetate andn-butanol, respectively. The dried product was dissolved with methanol and diluted into different concentrations to treat the winter wheat seeds. The results showed that the petroleum-ether extract fromEnterobactersp. 74#, the chloroform extract fromAcinetobactersp. 108#, the chloroform extract fromBacillussp. 138#and the ethyl acetate extract fromKlebsiellasp. 149#had significant germination effect (p<0.05). The 1/2 dilution of the chloroform extract fromBacillussp. 138#had the best germination effect (p<0.01).

Polyphyllaendophyte; winter wheat seeds ; germination; extract

2014-10-07 *通讯作者 张 鹏(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：药用植物及其内生菌, E-mail: zhangpenghust@126.com

宋发军(1967-)，男，教授，研究方向：应用生物化学, E-mail:songfajun@scuec.edu.com

国家自然科学基金资助项目(31370118)，中南民族大学2014年硕士研究生学术创新基金(2014sycxjj112)

Q939.96

A

1672-4321(2015)03-0029-04