热烈庆祝中国药理学会成立30周年！玉郎伞多糖对药物性肝损伤小鼠的保护作用*

阮文福，段文明，梁杏梅，陈兆霓，黄仁彬

(广西医科大学药理学教研室，南宁 530021)

热烈庆祝中国药理学会成立30周年！玉郎伞多糖对药物性肝损伤小鼠的保护作用*

阮文福，段文明，梁杏梅，陈兆霓，黄仁彬

(广西医科大学药理学教研室，南宁 530021)

目的 探讨玉郎伞多糖对布洛芬(IBU)致小鼠肝损伤的保护作用及可能机制。方法 将昆明种小鼠随机分成6组，每组10只，即空白对照组(NC)，模型对照组，玉郎伞多糖大(600 mg·kg-1)、中(300 mg·kg-1)、小(150 mg·kg-1)剂量组及联苯双酯组(联苯双酯，150 mg·kg-1)。玉郎伞多糖大、中、小剂量组和联苯双酯组灌胃给予相应药物，每日1次，连续14 d。末次给药后2 h，除NC组外，其他各组灌胃IBU，200 mg·kg-1，制备小鼠肝损伤模型。造模后禁食不禁水20 h，测定天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(T-BiL)、碱性磷酸酶(ALP)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平；取肝组织行病理学检查，观察肝组织损伤程度。结果 与模型对照组比较，玉郎伞多糖各剂量组血清ALP、AST、ALT活性降低，T-BiL及IL-6、TNF-α水平降低；肝组织MDA水平降低，肝匀浆SOD及GSH-Px水平升高(P<0.05)。玉郎伞多糖可减轻肝细胞损伤程度。结论 玉郎伞多糖对IBU所致肝损伤小鼠具有保护作用，其机制可能与抗氧自由基损伤、抗脂质过氧化损伤及减少炎症因子释放等有关。

玉郎伞；多糖；布洛芬；保肝作用

由药物、免疫反应、病毒感染及代谢等因素引起的肝细胞坏死，进而导致综合征即为肝损伤[1]。近年来，由于药物联合应用、滥用以及用药不当等各种原因导致的急性药物性肝损伤不容小觑。常见致肝损伤的药物包括非甾体抗炎药(non-steroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)、肿瘤化学治疗(化疗)药、抗结核药以及部分中草药等[2-4]。NSAIDs被广泛用于治疗风湿性疾病和解热镇痛，但该类药物可引起多种不良反应，尤其以肝损伤最常见，临床表现为轻微肝功能异常、严重肝功能衰竭甚至死亡等[3-7]。其中布洛芬多引起肝细胞变性、坏死等急性肝损伤，临床则可能出现食欲减退、恶心、疲劳及黄疸等症状[6-10]。肝脏是机体重要的免疫器官，布洛芬引发肝脏损伤后，募集到肝脏的单核细胞和肝内的Kupffer细胞将被活化，并成为肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的主要来源，参与肝损伤过程。通过检测血清白细胞介素-6(interleukin-6 ，IL-6)和 TNF-α水平可预测肝细胞炎症程度[2-3]。

玉郎伞是广西壮族习用药材，为蝶形花科植物疏叶崖豆[MillettiapulchraKurzvar.laxior(Dunn)Z.Wei]的干燥块根，该药具有补气、补血及抗衰老等作用功效[11]。临床主要用于小儿智力低下、老年健忘及体弱多病症等的治疗[11-14]。其主要活性成分包括多糖、黄酮及皂苷类等，成分较复杂。本课题组研究人员经多年研究，证实玉郎伞多糖具有调节免疫和抗氧化作用，且对急性化学性肝损伤具有明显的保护作用，但其是否对布洛芬所致药物性肝损伤具有保护作用，笔者尚未见文献报道。笔者在本实验中研究玉郎伞多糖对布洛芬所致药物性肝损伤小鼠的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康昆明种小鼠，雌雄各半，体质量(20±2) g，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(桂)2011-0003，实验动物使用许可证：SYXK(桂)2011-0005。

1.1.2 药物与试剂 玉郎伞多糖(Yulangsanpolysaccharide，YLSPS，将玉郎伞50 g加入5倍量95%乙醇回流60 min，将乙醇挥干后加入纯化水400 mL煮沸2 h，离心后取上清液醇沉，多糖检验证实含量为67.80%，批号：20130929)，加入纯化水配制成YLSPS大剂量(600 mg·kg-1，YLSPSH)，YLSPS中剂量(300 mg·kg-1，YLSPSM)和YLSPS小剂量(150 mg·kg-1， YLSPSL)。布洛芬(ibuprofen，IBU)购于美国Sigma公司(批号：14883)；联苯双酯(biphenyldicarboxylate，BPDC)由北京协和制药厂提供(批号：20120606)；丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)试剂盒(批号：20130409)、谷氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)试剂盒(批号：20130409)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)试剂盒(批号：20130904)、总胆红素(total bilirubin ，T-BiL)试剂盒(批号：20130904)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒(批号：20130408)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(批号：20130420)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒(批号：20130410)以及考马斯亮蓝试剂盒(批号：20130809)均为南京建成生物工程研究所产品。TNF-α和IL-6酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.3 仪器 可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司，型号：722S)，高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂，型号：TGL-16G-A)，台式低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂，型号：TDL-5)，电子天平(Startorius公司，型号：BP190S)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-52AA)，三用电热恒温水箱(北京长源实验设备厂，型号：SHH.W21.Cr600)，彩色病理图文分析系统(重庆天海医疗设备有限公司，型号：PTPS-2011)。

1.2 方法

1.2.1 模型的制备与分组 取健康合格的昆明种小鼠60只，随机分成6组，每组10只，即空白对照组，模型对照组，联苯比酯组(BPDC，150 mg·kg-1)和YLSPS小、中、大剂量组(YLSPSL，YLSPSM，YLSPSH)。空白对照组及模型对照组灌胃给予0.9%氯化钠溶液10 mL·kg-1，其余4组小鼠分别灌胃给予相应药物，10 mL·kg-1，每日一次，连续2周。末次给药后2 h，空白对照组给予0.9%氯化钠溶液灌胃，10 mL·kg-1，其余各组按相同容量灌胃给予IBU 200 mg·kg-1。禁食不禁水约20 h后，取血及脏器测定。

1.2.2 血清TNF-α与IL-6水平检测 采用ELISA法测定血清TNF-α与IL-6水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.3 血清生化指标测定 给予IBU 20 h后小鼠经眼球取血，3 000 r·min-1(r=10 cm)离心10 min，分离上层血清，分装，按各试剂盒说明书测定血清AST(赖氏法)、ALT(赖氏法)、T-BiL(咖啡因比色法)和ALP(铁氰化钾比色法)水平。

1.2.4 肝组织生化指标测定 肝组织匀浆的制备：取肝脏右叶，用预冷的0.9%氯化钠溶液漂洗以除去积血，干净滤纸拭净后称定质量，并加适量预冷0.9%氯化钠溶液，制备成10%肝组织匀浆，4 ℃下3 500 r·min-1离心15 min，取上清液，分装。蛋白含量测定采用考马斯亮蓝试剂盒测定。

MDA、GSH-Px和SOD测定：肝组织匀浆中MDA(硫代巴比妥酸比色法)、SOD(黄嘌呤氧化酶法)以及GSH-Px(比色法)的水平测定均按试剂盒说明书要求进行操作，组织中蛋白含量用考马斯亮蓝试剂盒测定。

病理学检查：选取肝右叶相同部位肝组织，置于10%甲醛固定，苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色，光镜下观察肝组织损伤程度。参照文献[12]，肝组织损伤程度可分4级：0级(-)，肝组织具备正常结构，未见变性、坏死及炎细胞浸润；Ⅰ级(+)，肝小叶尚具备正常结构，但浑浊肿胀、气球样变或脂肪变性较明显，也见点状坏死；Ⅱ级(++)，肝小叶结构不甚清晰，可见明显灶状坏死并伴有炎症细胞浸润；Ⅲ 级(+++)，肝小叶结构不清，可见明显片状坏死并伴有炎症细胞浸润。

2 结果

2.1 YLSPS对小鼠血清ALT、AST、ALP与T-BiL水平的影响 模型对照组小鼠血清ALT、AST和ALP活性及T-BiL含量显著高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明造模成功。与模型对照组比较，YLSPS大、中剂量组，以及联苯双酯组小鼠血清ALT、AST和ALP水平以及T-BiL含量明显降低，均差异有统计学意义(P<0.05)，提示大、中剂量YLSPS保护肝组织活性与联苯双酯药相当。见表1。

2.2 YLSPS对小鼠肝组织MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影响 与空白对照组比较，模型对照组小鼠肝脏SOD和GSH-Px活性明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示小鼠急性肝损伤造模成功。YLSPS对上述变化均有较强阻滞作用。与模型对照组比较，YLSPS大、中剂量组与联苯双酯组肝组织SOD和GSH-Px活性差异有统计学意义(P<0.05)。

与空白对照组比较，模型对照组MDA上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，联苯双酯组和YLSPS中、大剂量组MDA水平均下降，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

2.3 YLSPS对小鼠血清TNF-α与IL-6含量的影响 见表3。与空白对照组比较，模型对照组小鼠血清TNF-α和IL-6水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，联苯双酯组，YLSPS大、中剂量组小鼠血清TNF-α和IL-6水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 6组小鼠血清ALT、AST、ALP与T-BiL测定结果

组别小鼠数剂量/(mg·kg-1)ALTASTALP(U·L-1)T⁃BiL/(mg·d-1)空白对照组10…42．22±9．2254．70±10．92130．78±41．140．48±0．11模型对照组10…123．79±29．13∗1138．84±33．20∗1302．21±83．79∗12．01±0．55∗1联苯双酯组1015063．66±16．57∗264．32±16．94∗2205．27±67．60∗20．64±0．15∗2YLSPS 小剂量组10150112．90±27．39119．55±25．24262．49±75．921．84±0．19 中剂量组1030088．81±20．01∗294．47±22．54∗2240．54±60．89∗21．32±0．15∗2 大剂量组1060072．78±18．42∗271．63±18．33∗2177．20±57．21∗20．83±0．21∗2

与空白对照组比较，*1P<0.05；与模型对照组比较，*2P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.05

表2 6组小鼠肝组织SOD、GSH-Px与MDA水平测定结果

±s

与空白对照组比较，*1P<0.05；与模型对照组比较，*2P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.05

表3 6组小鼠血清TNF-α与IL-6测定结果

Tab.3 Analysis results of the serum level of TNF-α and IL-6 in six groups of mice

组别小鼠数剂量/(mg·kg-1)TNF⁃αIL⁃6空白对照组10…38．46±9．7281．97±23．39模型对照组10…104．17±32．65∗1174．36±37．58∗1联苯双酯组1015051．45±12．41∗2115．82±28．64∗2YLSPLS 小剂量组1015090．93±18．97153．36±26．39 中剂量组1030074．09±15．44∗2137．12±32．75∗2 大剂量组1060055．74±9．01∗2120．26±19．84∗2

与空白对照组比较，*1P<0.05；与模型对照组比较，*2P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.05

2.4 肝组织病理学检查 空白对照组小鼠肝组织结构正常，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状整齐排列，肝血窦、肝细胞索规则排列，肝小叶结构完整，未见肝细胞变性、坏死等病理变化。镜下可见模型对照组小鼠肝细胞肿胀，小叶中心大片坏死，脂肪样变明显，汇管区及小叶内有炎性细胞浸润。YLSPS小剂量组大片肝细胞肿胀，小叶中心呈灶状坏死，肝细胞明显脂肪变性，汇管区及小叶内可见少量炎性细胞浸润。YLSPS中、大剂量组肝细胞坏死、变性及炎性细胞浸润程度有所减轻，比较其他部位病理结果发现YLSPS中、大剂量有较强的减轻肝组织损伤作用(表4，图1)。

表4 6组小鼠肝组织病理学检查结果

Tab.4 Hepatic histopathology of six groups of mice只

3 讨论

肝脏是体内最大、最主要的代谢器官，外源性和内源性化合物代谢等均需要通过肝脏来处理，因药物滥用或多种药物联合使用等均可能引起肝脏损害，即所谓药物性肝病(drug induced liver disease，DILD)。肝脏疾病是一类严重危害人类健康的疾病[2-3]。在欧美国家，药物是导致重症肝炎的最常见原因，其中以对乙酰氨基酚等NSAIDs最常见[15]。NSAIDs具有解热、镇痛和抗炎作用，临床应用也可引起多种不良反应，如胃肠道反应、胃肠道出血及肾损害等，其对肝脏的损害也逐渐引起重视[5，16]。近年来有关应用布洛芬导致重度肝脏损害的报道越来越多。但药物性肝损伤的机制较复杂，除药物本身及其代谢产物能引起中毒性肝损伤外，药物还能与肝细胞蛋白质等成分结合形成新抗原，并启动机体细胞或体液免疫，导致由免疫介导的肝损伤[2-4]。

A.空白对照组；B.模型对照组；C.联苯双酯组；D.YLSPS小剂量组；E.YLSPS中剂量组；F.YLSPS大剂量组

A.blank control group; B.model control group; C.biphenyldicarboxylate group; D.low-dose YLSPS group；E.medium-dose YLSPS group；F.high-dose YLSPS group

Fig.1 Strcture of hepatic histopathology in six groups of mice(HE，×100)

本研究结果显示，高、中剂量YLSPS能有效降低小鼠血清ALT、AST和ALP活性，且量效关系明显，提示YLSPS具有良好的保肝活性[17]。

TNF-α与IL-6大多时候处于一种高活性状态，在肝细胞自身免疫反应中起关键作用，且肝细胞损害程度以及病情严重程度与其存在密切联系[14]。本实验结果表明，布洛芬致肝损伤小鼠血清TNF-α和IL-6水平明显升高。YLSPSH和YLSPSM组小鼠血清TNF-α和IL-6水平明显降低。实验结果提示，YLSPS可能通过减少炎症细胞因子分泌而发挥护肝作用。

SOD作为动物体内非常重要的抗氧化酶系，其作用是清除过氧化物和自由基，从而减少脂质过氧化物生成且加速其清除，降低其对细胞和组织的损伤，有利于抗衰老。GSH-Px是重要的催化过氧化氢分解的酶，还原性GSH特异性催化过氧化氢还原反应，从而达到保护细胞膜结构与功能完整的作用。GSH-Px也能催化氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSH)转化为还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)并加速体内自由基清除，从而减轻自由基对生物膜中不饱和脂肪酸的破坏，有效减少肝脏脂质过氧化损伤，增强肝细胞对自由基的抵御能力。MDA是脂质过氧化的主要降解产物，是脂质过氧化自由基反应程度的指标之一，能间接反映脂质过氧化程度和肝细胞损伤程度。氧自由基损伤及脂质过氧化损伤是众多急性药物性肝损伤的主要作用机制[8，11-12]。本实验结果表明，大、中剂量YLSPS可以明显降低布洛芬所致急性肝损伤小鼠肝组织MDA含量，提高肝组织SOD及GSH-Px活性。提示 YLSPS对药物性肝损伤的保护作用可能与抗自由基并且抑制脂质过氧化损伤有关。

[1] 张建军，戴丹.抗肝衰复方对急性肝衰竭大鼠HMGB1和PCNA表达的影响[C].桂林：全国第3届中西医结合传染病学术会议暨中国中西医结合学会传染病专业委员会第2届委员会议论文汇编，2010：2.

[2] GRATTAGLIANO I，PORTINCASA P，PALMIERI V O， et al.Overview on the mechanisms of drug-induced liver cell death[J].Ann Hepatol，2002，1(4)：162-168.

[3] MICHAEL P H，CYNTHIA J.Mechanisms of drug-induced liver injury[J].AAPS J,2006，8(1)：48-54.

[4] WILLIAM M L.Drug-induced hepatotoxicity[J].New Engl J Med，1993，17(5)：477-485.

[5] AITHAL G P.Hepatotoxicity related to antirheumatic drugs[J].Nat Rev Rheumatol，2011，7(3)：139-150.

[6] BENNETT W E，TURMELLE Y P，SHEPHERD R W.Ibu-profen-induced liver injury in an adolescent athlete[J].Clin Pediatr (Phila)，2009，48(1)：84-86.

[7] WALKER A M.Quantitative studies of the risk of serious hepatic injury in persons using nonsteroidal anti-inflammatory drugs[J].Arthritis Rheum，1997，40：201-208.

[8] ILIC S，DRMIC D，ZARKOVIC K，et all.Ibuprofen hepatic encephalopathy，hepatomegaly，gastric lesion and gastric pentadecapeptide BPC 157 in rats[J].Eur J Pharmacol，2011， 667(1-3)：322-329.

[9]MOORTHY M，FAKURAZI S，ITHNIN H.The Histomor-phological analysis of liver following administration of low doses of diclofenac and ibuprofen[J].J Bio Sci，2009，9(7)：676-681.

[10] 王淑英，倪国栋.布洛芬致急性重症肝炎1例[J].中国临床药学杂志，2000，9(5)：316.

[11] 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准[S].南宁：广西科学技术出版社，1990：166.

[12] 付书婕，黄建春，王乃平，等.玉郎伞多糖对小鼠急性酒精性肝损伤保护作用的研究[J].中国药房，2009，20(6)：406.

[13] 黄仁彬，段小群，焦杨，等.玉郎伞提取物对小鼠急性化学性肝损伤保护作用及其机制的研究[ J].广西医科大学学报，2003，20(6)：874.

[14] 陈健，黄媛恒，王乃平，等.玉郎伞多糖和皂苷对氧自由基清除作用研究[J].中药药理与临床，2007，23(5)：100.

[15] MUNOZ-GARCIA A.Ibuprofen-associated hepatotoxicity：Analysis of case series included in the Spanish DILI registry[J].Hepatology，2011，54：206.

[16] RAINSFORD K D.Ibuprofen：pharmacology，efficacy and safety[J].Inflammopharmacology，2009，17(6)：275-342.

[17] 杨亚军，李庆耀，梁生林，等.车前草总三萜对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用[J].中成药，2012，24(1)：140-142.

DOI 10.3870/yydb.2015.07.005

Protective Effect ofYulangsanPolysaccharide Against Hepatic Injury in Mice

RUAN Wenfu，DUAN Wenming，LIANG Xingmei，CHEN Zhaoni，HUANG Renbin

(DepartmentofPharmacology，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Objective To investigate the protective effect ofYulangsanpolysacharide (YLSPS) and mechanism against ibuprofen-induced liver injury in mice. Methods The mice were randomly divided into the blank control(NC)， the model control，YLSPS at 150 mg·kg-1， 300 mg·kg-1，600 mg·kg-1groups and biphenyldicarboxylate (150 mg·kg-1BPDC) group.The mice were orally administered with corresponding agents once per day for consecutive 14 days，whereas the blank control group and model control group were orally administered with saline.Except the blank control group， all the other mice were orally administered IBU 200 mg·kg-1body weight 2 h after last lavagedof medicimes. The mice were fasted and watered ad lib for 20 h after model establishment.Activities of ALT，AST and ALP，content of T-BiL，TNF-α，IL-6 in serum；activities of SOD，GSH-Px and content of MDA in liver tissue were detected.The morphological pathology test was used to examine degrees of hepatic injury. Results Compared with the model control， YLSPS could obviously reduce activities of ALT，AST and ALP，content of T-BiL，MDA，TNF-α and IL-6, and increase SOD，GSH-Px and CAT (P<0.05), and then lessen the hepatic injury. Conclusion YLSPS showed potential protective effect against ibuprofen-induced liver injury in mice, the mechanism may be related to attenuating free radical injury and inhibiting lipid peroxidation and lowering release of inflammatory factors.

Yulangsan; Polysaccharide；Ibuprofen；Hepatoprotection

2014-05-22

2014-07-01

*广西科学研究与科技开发攻关项目(10124008-6)；广西地方性高发疾病防治研究重点实验室基金(KFJJ2010-22)；广西科技基础条件平台建设项目(No.12-97-20)

阮文福(1980-)，男，越南河内人，在读博士，主要研究方向：抗肝炎药物研究。电话：0771-5339805，E-mail：phucdhy@gmail.com。

黄仁彬(1955-)，男，教授，博士生导师，博士，主要研究方向：抗病毒性肝炎药、抗老年性痴呆药、抗心血管病药研究。电话：0771-5339805，E-mail：huangrenbin518@163.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)07-0866-05