骨关节炎相关生物标记物研究进展

周星彤，曹永平*，王京

(1.北京大学第一医院骨科，北京 100034；2.北京积水潭医院骨科，北京 100035)

综 述

骨关节炎相关生物标记物研究进展

周星彤1，曹永平1*，王京2

(1.北京大学第一医院骨科，北京 100034；2.北京积水潭医院骨科，北京 100035)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是指由多种因素引起的关节退行性病变，其病理特征为软骨破坏、软骨下骨硬化和滑膜炎症改变等。针对这一世界范围内老年人群致残的首要病因，目前的治疗手段主要包括疾病早期的保守治疗及晚期的人工关节置换手术。后者虽堪称唯一有效的治疗手段，但随之产生的严重并发症及巨额财务负担不容忽视。因此，如何更有效地在疾病早期进行诊断，以便制定可以延缓、甚至逆转病情进展的治疗方案，具有重要意义。

目前，OA的诊断依赖于病史和影像学检查的结合。其中，X线检查发现关节间隙狭窄(joint space narrowing，JSN)仍是OA诊断的“金标准”[1]。然而，X线检查很难发现早期骨、软骨和滑膜等关节结构的变化，其对于早期诊断的作用有限。MRI能够早期发现关节软骨的改变，但因价格昂贵，尚不能大规模用于OA的临床诊断。关节镜检查能够直观观察关节软骨的损伤及相应滑膜的炎症改变，然而其有创性及其潜在的并发症，使之不适宜广泛应用于OA的诊断和病情评估。

由此，为了更好地诊治OA，需要寻找更为安全、有效且便捷的早期诊断OA的方法，并为疾病的治疗、预后提供新的评价手段。

美国生物标记物定义工作组将生物标记物定义为能够客观反映某一生理、病理过程或治疗效果的生理指标[2]。在21世纪刚刚过去的10年中，许多人开始关注生物标记物，并将之作为OA早期诊断及疗效评价的手段进行研究。本文就近年来关于OA相关生物标记物的研究做一综述。

1 OA相关生物标记物

根据OA的病理改变，文献中将OA相关生物标记物分类为骨代谢生物标记物、软骨代谢生物标记物及滑膜代谢生物标记物[3]。随着近年来对于microRNAs以及OA疾病进展相关蛋白、软骨分化相关蛋白的研究，越来越多可能的生物标记物被提出。本文将近年来新提出的生物标记物归为其他OA生物标记物。

1.1 骨代谢生物标记物

1.1.1 Ⅰ型胶原代谢标记物 骨基质主要由Ⅰ型胶原组成，通过吡啶啉(pyridinoline，PYD)及脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline，DPD)交联分子组合在一起。关节退变过程中，PYD/DPD交联分子裂解，交联区的分子进入循环，其中小分子物质通过尿液排出，故尿液中PYD可作为生物标记物进行研究。

Ⅰ型胶原N末端端肽(N-terminal telopeptide of collagen Ⅰ，NTX-Ⅰ)和Ⅰ型胶原C末端端肽(C-terminal telopeptide of collagen Ⅰ，CTX-Ⅰ)是Ⅰ型胶原的降解产物，二者经尿液排出。Kelman等[4]对老年女性的研究表明，NTX-Ⅰ的含量与影像学髋OA的发展相关联。Bettica等[5]发现，进展期OA患者尿液中CTX-Ⅰ的含量高于非进展期OA及正常人群。其他研究表明，NTX-Ⅰ并不能单一应用于OA的诊断，原因是人体其他部位的骨代谢可能严重影响NTX-Ⅰ及CTX-Ⅰ的含量[6]。在急性前交叉韧带(Anterior Cruciated ligament，ACL)损伤的患者中，NTX-Ⅰ和CTX-Ⅰ含量也是升高的[7]。

1.1.2 非Ⅰ型胶原代谢标记物 骨钙素是骨和牙齿中的成骨细胞特异合成与分泌的一种非胶原蛋白，受多种维生素、激素和细胞因子的调节。Sowers等[8]研究表明，血清中骨钙素含量与骨关节炎严重程度相关。但在两者相关程度上，目前尚无一致结论。

1.2 软骨代谢生物标记物

1.2.1 Ⅱ型胶原代谢标记物 Ⅱ型胶原是软骨基质中含量最多、组织特异的蛋白。N端和C端前肽反映了其前体Ⅱ型前胶原的合成过程。人ⅡA型前胶原N末端原肽(type Ⅱ A N-propeptide，PⅡANP)和人Ⅱ型前胶原羧基端原肽(type Ⅱ C-propeptide，PⅡCP)分别用于测定ⅡA型及ⅡB型前胶原。Shinmei等[9]发现早期OA患者关节液中PⅡCP含量有所升高。而对已经确诊为OA的患者研究发现，血清PⅡANP的含量较正常人群降低[10]。另一项随访研究表明，进展期OA患者血清中PⅡANP的含量较对照组升高[11]，这可能与PⅡANP反映Ⅱ型胶原合成过程相关。

Ⅱ型胶原C端肽(C-terminal telopeptide of collagen Ⅱ，CTX-Ⅱ)是目前研究最多的OA生物标记物之一。大量研究证明，尿液CTX-Ⅱ(urinary CTX-Ⅱ，u-CTX-Ⅱ)含量与OA的发生、发展相关。Sarukawa等[12]的动物模型研究证明，u-CTX-Ⅱ含量的升高早于影像学变化，这表明u-CTX-Ⅱ有可能作为OA早期诊断的生物标记物。近期一项大样本研究发现，u-CTX-Ⅱ的含量与反映骨代谢的其他生物标记物(如尿液中的NTX-Ⅰ、CTX-Ⅰ和骨钙素)有明显相关性[13]。综上所述，u-CTX-Ⅱ含量在反映Ⅱ型胶原代谢的同时，可能也与体内的骨代谢相关。u-CTX-Ⅱ是否能像预期一样特异性地反映OA的发生及发展，仍有待更多的实验证实。

Kalaï等[14]对125名女性患者进行研究，结果表明u-CTX-Ⅱ的含量与OA的严重程度相关，而血清人Ⅱ型胶原螺旋肽(helical region of type Ⅱ collagen，HELIX-Ⅱ)的含量与OA的疾病进展相关。HELIX-Ⅱ可以作为潜在生物标记物进行研究。

Ⅱ型胶原C肽结构域(C-telopeptide domain of collagen Ⅱ，Col2CTX)反映Ⅱ型胶原的降解过程。Hunter等[15]的研究证明，MRI中已经出现软骨丢失的患者Col2CTX的含量并无明显变化。目前关于Col2CTX的研究较少，其作为OA的生物标记物的价值尚不清楚。

Ⅱ型胶原降解中产生的3/4片段的测定同样可以反映Ⅱ型胶原的降解过程。依据测定的序列不同分为短序列(C1，2C)和长序列(C2C)。前者同时反映Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的降解过程，后者特异性地反映Ⅱ型胶原的降解过程[16]。然而，Hunter在其研究中同时证明C1、2C和C2C含量与MRI中软骨丢失无明显关联[15]。

在3/4片段上的特异性序列Coll 2-1也被用于反映Ⅱ型胶原的降解过程。对于Coll 2-1的研究发现，尿液Coll 2-1的含量与膝OA的严重程度相关，且Coll 2-1含量的持续升高预示了OA的影像学进展[17]。

1.2.2 蛋白聚糖代谢标记物 蛋白聚糖是软骨基质中含量最丰富的蛋白质之一，对于软骨的生理过程起重要作用。通过抗体识别测定硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)链上的846表位能够反映蛋白聚糖的合成代谢。动物研究证明846表位含量在早期OA中即有上升[18]。而Hunter等人的研究结果却相反[15]。Epitope 846对于OA早期诊断的意义有待进一步研究。

硫酸角质素(keratan sulfate，KS)被认为可以反映蛋白聚糖分解代谢的生物标记物。研究表明，K-L分级0～1级的患者血清KS含量高于K-L分级2～4级的患者[19]。这说明KS可以用于早期OA的识别。

1.2.3 非Ⅱ型胶原、非蛋白聚糖代谢标记物 软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)也是目前研究很多的生物标记物之一。有研究表明，OA患者血清COMP(serum COMP，s-COMP) 的含量明显高于正常人群，且与年龄和BMI呈正相关，但是与OA患者K-L分级无明显关系[20]。针对去酰胺基COMP(Disamidated COMP，D-COMP)的研究表明，D-COMP与髋关节OA的严重程度相关，而与膝关节OA无明显关系。而完整的COMP分子的含量则与膝关节OA相关，而与髋关节OA无明显关系[21]。D-COMP是目前已知的第一个具有关节特异性的生物标记物，它的存在给生物标记物的研究提供了新的思路。

衰老关键蛋白3(Fibulin-3，Fib3)与基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metallo proteases，TIMPs)相关，参与OA的发生与发展。Fib-3可分为Fib3-1及Fib3-2。Henrotin等[22]研究发现，OA患者尿液Fib3-1及Fib3-2的含量较正常人群升高。Fib3-1及Fib3-2有可能成为OA诊断的生物标记物。

Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的降解过程都有基质金属蛋白酶(matrix matalloproteinases，MMPs)的参与。金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue Inhibitor of Metalloproteinases，TIMPs)是由结缔组织产生，特异性地抑制MMPs活性的分子。研究证实，OA患者血清TIMP-1含量可能与OA的进展相关[23]，MMPs相较于TIMP的过量增加则可能提示OA的发生[24]。

戊糖素是一种糖基化终末产物(advanced glycation end-products，AGEs)，连接赖氨酸与精氨酸蛋白交联结构。Verzijl等[25]研究表明，OA患者尿中戊糖素水平较对照组升高，其升高水平与OA相关，且与年龄及BMI不相关。

1.3 滑膜代谢生物标记物 糖基-半乳糖基-吡啶诺林(Glucosyl-Galactosyl-Pyridinoline，Glu-Gal-PYD)在人类滑膜组织中含量丰富，能够特异性地反映滑膜组织的降解。研究发现，Glu-Gal-PYD和u-CTX-Ⅱ的含量在男性膝关节OA患者体内较高，并且与疾病严重程度相关[26]。

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是关节软骨及滑液的重要成分，但同时也分布在人体其他组织中。研究表明，OA患者血清HA含量较正常人群升高，且与OA的严重程度相关[27]，但这一点受许多因素影响。

人软骨糖蛋白-39(human cartilage glycoprotein-39，YKL-40)与软骨细胞及滑膜细胞分泌的壳多糖酶含量相关。一些研究证实，YKL-40在OA患者体内的含量较正常人群升高[2]，因而其被作为滑膜代谢生物标记物进行研究。

1.4 其他OA生物标记物

1.4.1 MicroRNAs MicroRNAs是包含9～25个核苷酸分子的非编码RNA，能够广泛调节细胞内各项生理活动。多种microRNAs参与OA发病及软骨发育、分化。Beyer等[29]研究表明，血清中miR-let7e、miR-454及miR-885-5p与严重OA相关。这是第一次研究血清microRNA与OA的关系。目前可以通过基因芯片及RT-PCR等方法检测体液中microRNAs的含量，并研究其与OA疾病严重程度、预后及疗效的关系。

1.4.2 脂肪因子 肥胖被认为是OA发病的相关因素。超重会增加负重关节的机械承重，从而导致关节软骨的退变。脂肪因子在骨及软骨稳态中发挥重要作用。与OA相关的脂肪因子主要包括瘦素、脂联素、内脂素和抵抗素。Poonpet等[30]发现瘦素、内酯素及抵抗素在OA患者中表达升高，脂联素在OA患者中表达降低。然而，脂肪因子在其他组织内也有广泛表达，故需联合其他生物标记物共同应用。脂肪因子可能对于监测疾病进展及预测药物治疗预后起到一定作用。

1.4.3 内皮素-1 大量证据表明，骨关节炎可能是一种炎性疾病。一些炎症因子参与骨关节炎的发病过程，内皮素-1(endothelin-1，ET-1)即为其中一种。ET-1能够参与细胞分化及纤维化过程。Sin等[31]研究发现，ET-1参与软骨下骨硬化过程，并能刺激软骨及滑膜细胞产生MMP-1、MMP-13，从而加速关节软骨的退变。目前ET-1可能作为一种新型生物标记物用于疾病诊断及预后评估。

1.4.4 丛生蛋白及润滑蛋白 血清及关节液蛋白有潜力成为OA相关生物标记物。Ritter等[32]通过质谱分析方法，对血清及关节液中大量蛋白进行筛选，发现将丛生蛋白及润滑蛋白联合分析可以预测OA的进展，这也为应用质谱分析方法进行大范围蛋白质筛选生物标记物提供了支持。

1.4.5 Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-4(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-4，ADAMTS-4) Li等[33]研究表明，血清中含ADAMTS-4的水平在早期OA患者中升高明显，与健康人中、晚期OA患者相比，差异具有统计学意义。因此，ADAMTS-4有望成为早期OA诊断的生物标记物。

1.4.6 缺氧诱导因子-1a(hypoxia-inducible factor-1a，HIF-1a) HIF-1a是PAS区域转录因子的一种亚单位，与关节软骨对抗缺氧的微环境相关，参与OA的发病。Chu等[34]研究表明，血清及关节液中HIF-1a的水平与OA的X线片严重程度相关，可能作为一种新型生物标记物。

1.4.7 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) VEGF是细胞分泌的能够促进血管再生的一种生长因子。Saetan等[35]研究表明，OA患者血浆及关节液中VEGF的水平与OA的严重程度相关，可能作为一种新型生物标记物。通过对以上OA相关生物标记物的分类总结，其概要分类及BIPED分级见表1。

2 OA相关生物标记物的临床应用

Bauer等[36]在2006年提出了著名的BIPED标准，用于生物标记物的分类。目前，这一分类标准已广泛地应用于OA生物标记物研究领域。BIPED标准将OA生物标记物根据用途分为5类，即病情评估、尚处于研究阶段的生物标记物、预后评估、治疗有效性评估以及诊断。

2.1 OA生物标记物与诊断 生物标记物在OA的早期诊断中具有天然的优势，在影像学改变尚未出现时，体液生物学标记物即已出现明显变化[37]。研究证明，外伤后及早期OA患者关节液PⅡCP和CTX-Ⅱ的含量较对照组升高[38]。Dragomir等[39]研究发现，在出现髋关节症状的患者中，s-COMP的升高早于影像学变化的出现。针对膝关节患者的研究则并未发现此项关系。近来关于KS的研究得到了相似的结论：早期OA患者尚未出现影像学改变时，其血清KS含量已经出现明显升高[19]。

单一的生物标记物并不能完全反映OA的全部病理过程。因此，将不同的生物标记物联合测定有可能提高诊断的有效性。Cibere等[40]对已出现MRI变化而尚无X线改变的患者研究证明，相比单一的生物标记物，将软骨分解与合成代谢的标记物结合后具有更高的特异性。

另一方面，作为诊断工具，需要一个明确的数值来区分OA患者及正常人。尽管许多生物标记物的含量在患者及正常人群之间显现了统计学差异，二者实际上有很大重叠，也很难得到用于诊断的临界值。

因此，尽管许多研究证实了生物学标记物在OA诊断中的价值，其真正应用于临床仍有待进一步的研究和随访。

2.2 OA生物标记物与病情评估 目前OA疾病严重程度的评价指标主要包括症状评分及影像学评价。K-L分级评分是最常用的影像学评价系统。Clark等[41]研究发现，s-COMP的含量与OA患者的K-L分级相关。Kraus等[42]针对血清HA、s-COMP及u-CTX-Ⅱ的研究显示，这些生物标记物的含量与患者关节间隙狭窄及骨赘形成的程度相关。相较于单纯髋关节OA的患者，伴有其他关节OA的患者其血清PⅡCP及C2C的含量明显下降，这一现象说明这些患者体内的Ⅱ型胶原合成代谢明显减少[43]。近来的研究发现，其他许多生物学指标也与K-L分级相关。

OA病情评估同样需要一个定量的“金标准”来区分病情轻重。但是目前对生物标记物研究仍很局限，尚无病情分级的“金标准”可以依据。另一方面，OA的病理过程复杂，单一生物标记物可能并不能反映所有类型的OA进程。在病程的不同阶段，同一生物标记物的含量也可能发生变化。2.3 OA生物标记物与预后评估 OA的病理过程极为复杂，预后判断十分困难。鉴于不同的预后可能影响患者治疗方案的选择，许多研究致力于寻找有效的参数进行OA预后的判断，既往基于影像学改变的预后评估是十分不准确的。目前，许多研究者认为生物标记物能够应用于OA预后的判断。

表1 生物标记物分类及BIPED分级3

在OA的病理过程中，软骨下骨的病理变化十分重要。因此，反映Ⅰ型胶原代谢的生物标记物常常被用作判断预后。Eckstein等[44]使用MRI技术随访OA患者关节软骨退变情况，并与基线生物标记物含量比较。其研究指出，在反映Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、软骨代谢以及滑膜炎症的共16种生物标记物中，基线血清CTX-Ⅰ含量是唯一与关节软骨退变相关的指标。

在OA预后判断领域，CTX-Ⅱ是目前研究最多的生物标记物。研究指出，在髋关节OA患者中，基线u-CTX-Ⅱ含量升高预示着疾病快速进展[45]。在另一项针对髋、膝关节OA患者的大样本随访研究中得出了相似的结论，并指出高基线u-CTX-Ⅱ含量与疾病进展之间的关系是独立于其他已知的OA风险因素的[46]。一项纳入了10种生物标记物，针对333 例髋关节OA患者的随访研究提示，高基线u-CTX-Ⅱ含量及s-HA含量与OA快速进展相关[47]。然而，一项类似的研究得出了相反的结论，Raynauld等[48]随访107 例OA患者24个月后，发现基线u-CTX-Ⅱ含量与软骨丢失之间无显著关联。

COMP也是这一领域研究较多的生物标记物之一。一项随访研究表明，OA进展患者的基线s-COMP含量明显高于无病情进展的患者[49]。Hunter等[50]对C1，2C、C2C、PⅡCP、846 epitope和COMP等反应软骨代谢的生物标记物进行血清含量检测，发现只有s-COMP的基线含量与MRI反映的软骨丢失相关。

研究证实，血清HA含量的降低与疾病进展相关[51]。OA进展患者u-NTX-Ⅰ和u-CTX-Ⅰ的变化较未进展组明显，反映了OA进展时骨转换的增高[5]。一项大规模长期随访研究监测了s-COMP及u-CTX-Ⅱ含量，发现其变化与OA严重程度相关，并能够预示关节僵硬和疼痛的发生[52]。一项针对血清超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNFα)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)与膝关节疼痛程度关系的随访研究发现，三者的基线含量和变化与疼痛程度具有相关性[53]，这一研究说明炎症因素在膝关节疼痛的发生发展中有重要作用。

综上所述，目前对于OA生物标记物与预后评估的研究十分广泛。s-HA、s-COMP及u-CTX-Ⅱ都有可能作为判断预后的指标，但目前的研究显示，许多结果十分模糊甚至自相矛盾。虽然这与研究对象、随访时间、终点事件的选择以及判断标准等许多因素相关，但这也反映了我们对这个领域的认识并不十分清楚。因此我们需要更多的研究，特别是大样本长时间的随访研究，来确定生物标记物在OA预后判断领域的价值。

2.4 OA生物标记物与疗效判断 OA病情进展缓慢，因而很难选择一个终点事件以证明治疗手段的效果，生物标记物的研究在这一领域有重要的价值。相较于影像学能够反映结构变化，生物标记物则能够反映出关节内组织的代谢变化，这可能是最早对治疗产生应答的终点事件[54]，许多研究证实了生物标记物在OA疗效判断上的价值[55]。尽管许多生物标记物具有一定特异性，但其变化并不一定反应治疗的临床应答，可能受其他因素影响，而缺少特定阈值也使得疗效判断变得困难。

3 总结与展望

目前关于OA相关生物标记物的研究仍然是热点话题。较前的研究提示了OA相关生物标记物在疾病的早期诊断、病情及预后评估、疗效评价等方面都起到了一定作用，但是，目前尚无一种生物标记物被应用于临床。分析其原因，与目前提出的生物标记物的敏感性、特异性较差，相关临床试验病例数较少相关。虽然每年新提出的生物标记物种类、数量都明显升高，但能够真正具备临床应用价值的却很少。

未来的研究方向：一方面可以通过芯片技术等进行大规模相关蛋白的筛选，寻找敏感性、特异性更好的新的生物标记物；另一方面，对于已经有深入研究的可能应用于临床的生物标记物进行更大范围人群的验证，并将之应用于临床。

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1008-5572(2015)10-0907-07

北京大学医学部医学交叉学科种子基金(BMU20140392)；*本文通讯作者：曹永平

R684.3

A

2015-06-23

周星彤(1991- )，男，医师，北京大学第一医院骨科，100034。