铁线透骨草中槲皮素的提取条件优化及含量测定

赵恒成，耿凯凯，李少坡，汤彦丰，李 娜，梁惠花，甄 攀

(河北北方学院，河北 张家口 075000)

铁线透骨草中槲皮素的提取条件优化及含量测定

赵恒成，耿凯凯，李少坡，汤彦丰，李 娜，梁惠花，甄 攀

(河北北方学院，河北 张家口 075000)

目的 利用正交试验研究铁线透骨草中槲皮素的最佳提取条件，测定不同批次铁线透骨草中槲皮素的含量。方法 设置L9(34)正交试验，安排提取温度、溶媒(甲醇)量、提取时间、加盐酸量4个因素，HPLC法检测；色谱柱：Hypersil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1%乙酸(50∶50)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测波长：375 nm。结果 最佳提取条件为：样品量约2.0 g，加入35 mL甲醇、10 mL浓盐酸，浸泡0.5 h，于40 ℃超声震荡提取40 min。在此条件下测定的8个批次铁线透骨草中槲皮素的含量为0.109 9～0.880 3 mg·g-1。结论 提取方法效率高、时间短、温度低，是提取铁线透骨草中槲皮素较好的方法。不同批次铁线透骨草中槲皮素的含量相差较大。

铁线透骨草；槲皮素；HPLC；正交试验

透骨草基源混乱，同名异物现象非常严重。据统计，记载为透骨草的原植物共计21科44种5变种[1,2]。这些来源于不同科属的商品名均为透骨草的植物，在化学成分、药理作用、功效和毒性等方面不尽相同[3,4]。在河北、北京、内蒙古等北方地区将黄花铁线莲(ClematisintricataBunge)作为透骨草使用，称为铁线透骨草。目前对于透骨草的研究大多限于风仙透骨草和珍珠透骨草[5,6]，对于铁线透骨草的研究报道较少。槲皮素是其重要的黄酮类活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗过敏、抗菌、抗病毒、清除体内自由基、抑制恶性肿瘤生长和转移[7-10]等多方面药理作用。本文基于均匀设计方案研究了铁线透骨草中槲皮素的最佳提取条件，并测定不同批次铁线透骨草中槲皮素的含量。

1 材料与方法

1.1 药材

文中所用铁线透骨草样品，有6种为张家口市市售药材，2种由作者采集，均经河北北方学院中医学院赵恒成老师鉴定为黄花铁线莲(ClematisintricataBunge)。正交试验所用药材为样品1。具体如下：

样品1：2012年3月购自张家口华佗药房长青路店；

样品2：2013年4月购自张家口华佗药房纬一路店；

样品3：2013年4月购自河北北方学院校医院；

样品4：2013年4月购自张家口华佗药房长青路店；

样品5：2013年4月购自张家口德仁堂药房长青路店；

样品6：2013年4月购自张家口南山堂药房公园路店；

样品7：2010年采自河北涿鹿杨家坪；

样品8：2013年采自河北涿鹿杨家坪。

1.2 试剂

槲皮素标准品：中国食品药品检定研究院提供，批号：100081-200907。

甲醇(色谱纯)、浓盐酸(分析纯)、冰乙酸(分析纯)。

1.3 主要实验仪器

Agilent HP1100高效液相色谱仪。

2 方法与结果

图1 槲皮素色谱图 图2 铁线透骨草色谱图

2.1 色谱条件

Hypersil ODS C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色谱柱(美国 Thermo)；甲醇-0.1%冰乙酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长：375 nm；进样量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃。色谱图见图1和图2，图中“1”为槲皮素(quercetin)峰。

2.2 标准曲线

精密称取1.13 mg槲皮素对照品置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得22.6 μg·mL-1的槲皮素对照品溶液。

将对照品溶液按倍数稀释成0.71、1.41、2.83、5.65、11.3、22.6 μg·mL-1，分别进样，进样量20 μL，峰面积分别为48.5、76.8、217.2、483.3、1 025.9、2 174.1 mAU。以槲皮素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为y=97.931x-55.356，r2=0.9993。线性范围0.71～22.6 μg·mL-1。

2.3 L9(34)正交试验

甲醇为提取溶剂，超声震荡法提取。以槲皮素含量为指标，设计L9(34)正交试验。各样品的重量约为2.0 g，均精密称定，用提取溶剂浸泡0.5 h，各试验均平行2份。实验因素和水平见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验的因素和水平

表2 L9(34)正交试验结果

表3 方差分析表

由正交试验结果可知，提取槲皮素的最佳条件为A2B2C3D2，即用35 mL溶媒(甲醇)，10 mL浓盐酸，浸泡0.5 h，然后于40 ℃超声震荡提取40 min。

2.4 方差分析

对以上正交试验结果进行方差分析，见表3。

方差分析结果显示，槲皮素的提取时间、提取温度、加浓盐酸量和溶媒(甲醇)量均为显著性影响因素(P<0.01)，其中提取时间和溶媒(甲醇)量影响尤其显著。

2.5 样品中槲皮素的含量测定

取以上8个批次的铁线透骨草样品，按最佳提取条件提取，在上述色谱条件下测定槲皮素的含量。见表4。

表4 样品中槲皮素的含量

3 讨论与结论

1)药物分析中，经常会遇到多因素多水平的问题，例如提取中草药中的有效成分，提取效率常受到提取液的种类及组成、提取时间、浸泡时间、溶液的pH等条件的影响。为了寻找最优提取条件，常安排多因素多水平正交试验，通过有限的实验次数，再通过合理的统计分析，即可得出最优提取条件。但要注意，当正交试验表中所有因素都排满时，要进行重复试验，否则无法进行方差分析。

2)前期试验研究了加酸和不加酸对槲皮素含量的影响，结果表明加酸后槲皮素的含量有显著提高，所以本试验探讨了加酸量的影响。前期试验中比较了冷浸取、超声提取、索氏提取和回流提取对槲皮素含量的影响，结果是超声提取效果更佳，所以本实验采用超声提取法。用本文得到的方法提取槲皮素，效率高、时间短、温度低，是提取铁线透骨草中槲皮素较好的方法。

3)8个批次铁线透骨草中槲皮素的含量为0.109 9～0.880 3 mg·g-1，而且色谱图也有区别，说明不同批次铁线透骨草中槲皮素的含量相差较大，化学成分不尽相同，可能与其生长环境有关。

[1]顾宗京,鲍爱华.中药透骨草同名异物现象剖析[J].中草药,2000,31(03):432-237.

[2]陈津慧.中药透骨草的异物同名品种辨析[J].内蒙古中医药，2014,(25):50-51.

[3]杨林，钱娇玲，蒲利红，等.棉团铁线莲总皂苷抗肿瘤活性研究Ⅱ[J].中医药学报，2013，41(02)：51-53.

[4]卢莉娜，赵伟赛，李丹，等.湖州铁线莲乙醇提取物体外抗K562与MGC-803活性研究[J].浙江中医药大学学报，2012，36(07)：845-848.

[5]索金红，伊勋非.珍珠透骨草的化学成分及药理作用[J].内蒙古民族大学学报：自然科学版，2009，24(05):506-508.

[6]陈秀梅，钱士辉，冯锋.凤仙透骨草的化学成分[J].药学与临床研究，2009,17(01):31-33.

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[9]Lee K W,Kang N J,Heo Y S,et al.Raf and MEK protein kinases are direct molecular targets for the chemopreventive effect of quercetin,a major flavonol in red wine[J].Cancer Res,2008,68(03):946.

[10]Shaik Y B,Castellani M L,Perrella A,et al.Roles of quercetin(a natural herbal compound)in allergy and inflammation[J].J Biol Regul Homeost Agents,2006,20(3～4):47.

[责任编辑：刘守义 英文编辑：刘彦哲]

Optimization of Extraction Conditions and Determination of Quercetin fromClematisIntricataBunge

ZHAO Heng-cheng,GENG Kai-kai,LI Shao-po, TANG Yan-feng，Li Na，LIANG Hui-hua，ZHEN Pan

(Hebei North University，Zhangjiakou,Hebei 075000，China)

Objective To study the optimal extraction conditions of quercetin fromClematisintricataBungeby orthogonal test and determine contents of quercetin in different batches ofClematisintricataBunge.Methods Setting the L9(34)orthogonal test table,arranging four factors:extraction temperature,amount of solvent(methanol),extraction time and amount of hydrochloric acid.Detecting by HPLC;column:Hypersil C18(5μm,4.6 mm×250 mm),mobile phase:CH3OH-0.1% CH3COOH(50∶50),flow rate:1.0 mL/min,column temperature:25 ℃;determining wavelength:375 nm.Results The optimal condition was that the sample with about 2.0 g conical flask with plug was poured 35 mL CH3OH and 10 mL concentrated hydrochloric acid,then was soaked about 0.5 h,and extraced 40 min at the temperature of 40 ℃ with ultrasound concussion.Conclusion The extraction method could have high efficiency,short time and low temperature,and be better to extract quercetin fromClematisIntricataBunge.The contents of quercetin could differ significantly in different batches ofClematisIntricataBunge.

ClematisintricataBunge；quercetin；HPLC；orthogonal test

河北省中药局资助项目(2013077)；河北北方学院应用化学创新团队(CXTD1306)

赵恒成(1963-)，男，山东武城人，河北北方学院中医学院实验师。

甄攀(1965-)，女，河北曲阳人，硕士，教授，硕士生导师，研究方向为药物化学及药物分析。

R 284.1

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2015.02.004

来稿日期：2014-12-04