盐肤木种子蛋白质提取工艺的初步优化

何晓梅，陈存武，陈乃富，韩邦兴，谷仿丽

1.皖西学院生物与制药工程学院；2.植物细胞工程安徽省工程技术研究中心，安徽六安，237012

盐肤木种子蛋白质提取工艺的初步优化

何晓梅1,2，陈存武1,2，陈乃富1,2，韩邦兴1,2，谷仿丽1,2

1.皖西学院生物与制药工程学院；2.植物细胞工程安徽省工程技术研究中心，安徽六安，237012

通过凯氏定氮法测定盐肤木种子总蛋白质含量，然后采用3种不同的方法提取其中的蛋白质。结果表明：盐肤木种子总蛋白质的含量约为9.501%。在本实验条件下，改良丙酮沉降法提取的蛋白质含量较TCA-丙酮提取法和碱式提取法高。正交试验确定改良丙酮沉降法较优工艺条件为:“料液比为1∶12 g·mL-1，提取时间为3 h，提取液与沉降蛋白所用丙酮量体积比1∶2，沉降时间为1.5 h。在较优提取工艺条件下，盐肤木蛋白质的提取率达到58.44%。

盐肤木；蛋白质；凯氏定氮法；提取；正交试验

盐肤木(Rhuschinensis)又名为“五倍子树”，是漆树科盐肤木属的落叶灌木或小乔木;角倍蚜(Schlechtendaliachinensis)是瘿绵蚜科昆虫的1种。五倍子是由角倍蚜在其唯一夏寄主植物盐肤木叶总轴的翅叶上形成的虫瘿(角倍)，含有丰富的单宁，是医药、化工、食品、轻工和环保等行业的重要原料。因此，目前人们对盐肤木的研究主要集中于盐肤木的播种育苗及栽培技术[1-4]、角倍蚜虫瘿对盐肤木生理生化特性的影响及其关系上[5-7]等，以期提高五倍子的产量。此外，国内学者还对盐肤木的分子生物学特性、逆境生长特性、病虫害防治等进行了相关研究。

近年来，盐肤木及五倍子有效成分的提取及其生物活学研究有了很大进展，提取的成分有五倍子多酚、五倍子酸、盐肤木黄酮等；提取部位有五倍子、根、茎、叶和种子等；生物学效应有抗氧化、抗肿瘤、抗病虫害、抑菌等[8-11]。陈存武等研究表明，盐肤木种子含有丰富的油脂、蛋白质、脂肪、还原糖、矿质元素等，其中蛋白质含量为9.61～11.64 g/100 g[12]。陈宏伟等采用酸水解法，对我国亚热带常见的119种森林植物种子的蛋氨酸含量进行测定，结果表明盐肤木的蛋氨酸含量达到36.89 mg/g ，为119种植物中含量最高者[13]。本研究采用改良丙酮沉降法、TCA-丙酮提取法和碱式提取法三种不同的方法提取盐肤木种子中的蛋白质，并对提取率较高的改良丙酮沉降法进行正交试验优化，确定盐肤木蛋白质提取的优化参数，以期为盐肤木种子蛋白质的进一步研究提供基础性数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

盐肤木种子采摘于霍山县白马尖，经分拣、晾晒后粉碎，50℃烘干至恒重备用。

1.2 主要仪器与试剂

主要仪器：凯氏定氮装置(天长市长城玻璃仪器制造厂)，GL-21M高速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)，DK-8D三孔三温水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有限公司)，HL-500A型高速多功能粉碎机(上海塞耐机械有限公司)，UV-2102 PCS型紫外可见分光光度计(尤尼科上海仪器有限公司)，智能型电热恒温鼓风干燥箱(上海琅王干实验设备有限公司)。

主要试剂：氢氧化钠、盐酸、丙酮、TCA(三氯乙酸)等，均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 盐肤木种子蛋白质含量的测定：凯氏定氮法

准确称取经(40±2)℃干燥至恒重的样品，平均分成3组，参考文献[14]进行蛋白质总量的测定。计算公式如下：

式中，X为样品中蛋白质的百分含量，g；V1为样品盐酸标准液的体积，mL；V2为试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积，mL；N为盐酸标准溶液的当量浓度；0.014为1 N盐酸标准溶液1 mL相当于氮克数；m为样品的质量(体积)，g(mL)；F为氮换算为蛋白质的系数。

1.3.2 盐肤木蛋白质的不同提取方法

1.3.2.1 改良丙酮沉降法

按照谷瑞升等[15]的方法，准确称取1.217 1 g盐肤木样品粉末，加入12 mL蛋白质提取液(表1)，在研钵中充分研磨混匀后转入50 mL离心管中，室温超声5 min后于4℃条件下提取1 h使蛋白质充分溶解，12 000 r/min离心20 min，取清液，加入3倍体积-20℃预冷的丙酮并于-20℃下放置1 h使蛋白沉淀，12 000 r/min离心20 min，弃上清，丙酮完全挥发后按1∶5(w/v)加入蛋白溶解液(表1)溶解沉淀，转移至离心管中，12 000 r/min离心10 min，取上清液，即为所提取的蛋白溶液(上述操作都在4℃进行)。

1.3.2.2 TCA-丙酮提取法

按照董双涛等[16]的方法略作修改，准确称取1.203 0 g盐肤木样品粉末，按1∶3(w/v)加入-20℃预冷的三氯乙酸和丙酮液(含10%(w/v)TCA和0.07%(v/v)β-巯基乙醇)研磨充分后转入离心管中，-20℃沉降50 min，4℃12 000 r/min离心20 min，取沉淀置-20℃预冷的80%丙酮中(含0.07%β-巯基乙醇)，-20℃沉降1h，4℃12 000 r/min离心20 min，重复洗涤沉淀至无色，沉淀真空干燥，按1∶5(w/v)加入蛋白溶解液(表1)，4℃放置3 h，12 000 r/min离心20 min，获得上清液，即为所提取的蛋白质溶液。

表1 提取试剂配方

注：提取液与上样缓冲溶液按表1配制好后，均加蒸馏水定容至100 mL。

1.3.2.3 碱式提取法

按照陶然等[17]的方法略作修改：准确称取1.256 0 g的样品，按1∶10加入水，搅匀后加入3%的氢氧化钠溶液，调节pH至10，于50℃左右的水浴锅中，不断缓慢地搅拌，使蛋白质在碱性条件下溶解，离心保留提取液，调节pH至4.5，12 000 r/min离心分离，取沉淀，按1∶5加入蛋白溶解液，充分溶解蛋白后12 000 r/min离心分离，得蛋白质溶液。

1.3.3 正交试验优化改良丙酮沉降法

比较3种不同蛋白质提取方法的结果，确定进一步优化改良丙酮提取法。以物料与提取液配比、溶解时间、物料与沉降液配比、沉降时间为考察因素，以蛋白质提取率为考察指标，进行L9(34)实验(表2)。

表2 正交试验因素水平表

1.3.4 蛋白质提取率计算

采用Bradford法测定提取液中蛋白质含量[18]。样品中蛋白质的含量(ug/g)=C×VT/(V1×m)，式中，C为查标准曲线值(μg)；VT为样液总体积(mL)；m为样品质量(g)；V1为测定时加样量(mL)。

2 实验结果与分析

2.1 盐肤木种子中蛋白质总量的测定

准确称取3份样品进行平行试验及空白试验，由表3可以看出盐肤木中蛋白质的总含量约为9.501%，即100 g盐肤木中约含9.501 g蛋白质。

表3 盐肤木种子中蛋白质总量

2.2 蛋白质标准曲线的绘制

取6支10 mL干净的具塞试管，按表4进行取样后盖上塞子，将各试管中溶液纵向倒转混合均匀，放置2 min后用1 cm光径的比色皿在595 nm波长下进行比色，并记录各试管测定的光密度OD595 nm，然后绘制出标准曲线(图1)，曲线回归方程为y=0.000 8x+0.008 3，R2=0.999 3。

2.3 不同提取方法获得的蛋白质提取率

采用3种不同的提取方法提取样品中的蛋白质，并通过紫外分光光度法在595 nm下测定样品提取液的吸光度，计算得知改良丙酮沉降法获得的蛋白质提取率为43.56%，TCA-丙酮提取法提取率为34.29%，碱式提取法蛋白质提取率为23.47%(表5)。

表4 考马斯亮蓝法绘制蛋白质标准曲线

表5 不同提取方法获得的蛋白质提取率

2.4 正交试验结果

由表6分析结果可知，通过正交实验优化改良丙酮沉降法，影响蛋白质提取效果因素的主次顺序为B>C>A>D，即溶解时间影响最大，依次是物料与沉降液丙酮配比、物料与提取液配比，预冷丙酮沉降时间影响较小，且最优水平为A2B3C1D2，即最佳提取工艺条件为：料液比为1∶12，提取溶解时间为3h，提取液与沉降蛋白所用丙酮量体积比1∶2，沉降时间为1.5h。

表6 正交实验结果及极差分析

2.5 蛋白质提取的验证试验

根据2.4获得的最佳提取条件，分别称取3份为1.003 2g、1.004 8g和1.001 7g的盐肤木样品进行实验，得出蛋白质提取率分别为57.33%、59.72%和58.27%，平均值为58.44%，与上述正交试验结果基本一致。

3 结 论

(1)凯氏定氮法对本次样品中蛋白质总含量的测定值为9.501g/100g盐肤木。

(2)分别通过改良丙酮沉降法、TCA-丙酮提取法、碱式提取法3种不同的提取方法提取盐肤木种子蛋白质并计算提取率，结果表明：在本实验条件下，新式改良丙酮提取法提取的蛋白质含量较其他2种方法高。

(3)运用正交优化改良丙酮沉降法的最优提取条件为：料液比为1∶12，提取溶解时间为3h，提取液与沉降蛋白所用丙酮量体积比1∶2，沉降时间为1.5h。在此实验条件下，蛋白质提取率为58.44%。

(4)根据1.3.2.2和1.3.2.3的实验条件，TCA-丙酮提取法和碱式提取法提取的蛋白质含量较低，在后续实验中需要进行实验条件的优化。

(5)盐肤木种子蛋白质的提取在国内尚属首次，本实验数据可为盐肤木种子蛋白质的进一步研究提供参考。

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(责任编辑：汪材印)

Preliminary Optimization of Extraction Process ofRhusChnensisSeed Protein

HE Xiaomei1,2, CHEN Cunwu1,2,CHEN Naifu1,2,HAN Bangxing1,2,GU Fangli1,2

1.School of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,West Anhui University,Luan Anhui,2370122.Engineering Technology Research Center of Plant Cell Engineering, Anhui Province,Luan Anhui,237012

The content of protein fromRhusChnensisseed was assayed by Kjeldahl determination and three protein extraction methods were employed. The results showed that the content ofRhusChnensisseed protein was about 9.501%. Protein extracted by the improved acetone sedimentation method was higher than by the TCA-acetone extraction and basic extraction method.The optimum process conditions of improved acetone sedimentation method by orthogonal test were: the ratio of solid to liquid 1∶12 g·mL-1,extraction time 3 h,the ratio of protein extraction solution to acetone 1∶2,sedimentation time 1.5 h.Practicing this optimal condition,the extraction rate ofRhusChinensisprotein reached 58.44%.The experiment data was referred for further study of theRhusChinensisseed protein.

RhusChinensis;protein;Kjeldahl determination;extraction;orthogonal test

10.3969/j.issn.1673-2006.2015.02.028

2014-11-25

国家公益性林业科研专项项目“盐肤木新品种选育与示范”( 201204312)；国家自然科学基金“基于近红外与电子鼻技术的药用菊花道地药材模式识别研究”(30901972)；安徽高校省级自然科学研究重点项目“新木本油料植物盐肤木油脂资源开发应用研究”(KJ2011A273)“生姜病毒检测试剂盒的研制与生姜脱毒快繁”(KJ2013A264)；安徽省自然科学一般项目“复合酶法制备纯天然速溶绿茶的研究”(KJ2013B341)。

何晓梅(1974-)，女，安徽霍山人，硕士，讲师，主要研究方向：天然产物研究与开发。

TS229

A

1673-2006(2015)02-0109-04