转化生长因子在银屑病皮损组织中的表达研究

柏 杨，李江涛，王 琳(.宜宾市第一人民医院风湿免疫科，四川 宜宾 644000；2.成都医学院第一附属医院血液风湿科，四川 成都 60050；.华西医院皮肤科，四川 成都 60000)

转化生长因子在银屑病皮损组织中的表达研究

柏 杨1，2，李江涛1，王 琳3
(1.宜宾市第一人民医院风湿免疫科，四川 宜宾 644000；2.成都医学院第一附属医院血液风湿科，四川 成都 610050；3.华西医院皮肤科，四川 成都 610000)

目的 探讨转化生长因子(transforming growth factor-beta l，TGF-β1)在银屑病发病机制中的作用，为银屑病的治疗提供一定的理论基础。方法 应用免疫组织化学SP法测定58例银屑病皮损组织(19例寻常型银屑病、20例脓胞型银屑病、19例红皮病型银屑病)皮损组织和10例正常皮肤组织TGF-β1的表达量，并进行比较分析。结果 定位表达显示：在正常皮肤组织中TGF-β1主要在表皮基底细胞中表达，表皮棘层及真皮中通常无表达或低表达；银屑病皮损组织中TGF-β1在真皮乳头层有明显表达，表皮(包括基底层)中无表达或低表达。定量测定显示，银屑病皮损组织中IOD/area较正常皮损组织高，差异有统计学意义(P< 0.05)；3种银屑病皮损组织间TGF-β1表达差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 TGF-β1表达异常可能在银屑病发病机制中有重要作用。

转化生长因子-β1；银屑病；免疫组织化学；细胞因子

银屑病是一种免疫介导的慢性、炎症性疾病，主要临床表现为皮肤出现鳞屑性红斑或斑块，还可伴有关节、心血管等其它系统损害。病情易反复，给患者生活带来巨大困扰，明显降低患者生活质量。银屑病的发生与发展受遗传和环境因素双重影响，发病机制目前还不完全清楚，已经发现有多种细胞因子与之相关[1]，包括表皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(transforming growth factor-beta l，TGF-β1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素(IL-6、IL-23)等。本研究采用免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)方法(SP法)检测58例银屑病患者皮损组织中TGF-β1表达，探讨TGF-β1在银屑病中的作用并为临床治疗提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 银屑病皮损组织来源于2006～2013年在四川大学华西医院和宜宾市第一人民医院58例确诊为银屑病患者，包括19例寻常型银屑病、20例脓胞型银屑病、19例红皮病型银屑病皮损组织。患者纳入标准：均有典型或较为典型的皮损，并经病理检查证实符合银屑病的组织病理改变，近3个月内未服用过糖皮质激素及免疫抑制剂，停止其他系统治疗和光疗法至少1个月，近3周内皮损未进行过局部治疗，不伴有可能影像研究结果的重要疾病。正常皮肤组织10例均为我院骨科手术时修剪的残余的四肢新鲜正常皮肤组织，包括表皮、真皮和皮下组织，大小为0.5 cm× 1.0 cm，局部无感染、出血、溃疡、肿瘤等，且为不易经常被摩擦处。正常皮肤组与银屑病各亚组性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P< 0.05)，具有可比性，见表1。

表1 各组一般资料情况

1.2 实验方法 所有标本均经10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋后制成蜡块备用。实验均采用免疫组织化学链酶亲和素-生物素法(SP法) 检测TGF-β1在皮肤组织的表达。实验步骤：①常规脱蜡、水化；② 3%H202阻断内源性过氧化物酶；室温孵育10 min，PBS洗 5 min×2次；③高温隔热水浴抗原修复；④封闭细胞Fc受体：封闭用羊血清(北京中杉金桥)封闭切片，置室温下孵育15 min，倾去多余血清(不洗)；⑤滴加一抗(1∶150小鼠抗人IgG型TGF-β1单克隆抗体—圣克鲁斯生物公司)，4 ℃过夜孵育；⑥室温下复温20 min，PBS液洗5 min×3次；⑦ 滴加二抗：滴加生物素标记的IgG型山羊抗小鼠抗体(北京中杉金桥)，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×2次；⑧ 滴加三抗：滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(北京中杉金桥)，37 ℃孵育30 min，PBS液洗5 min×2次；⑨DAB显色：滴加DAB液(武汉博士德)镜下观察适时终止(显色时间约3 min左右)；⑩常规苏木素复染、2%盐酸酒精分化、返蓝、脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照为正常皮肤组织，空白对照用PBS代替一抗。免疫组化阳性细胞定量方法：所有组织切片均由两位有经验的病理医师在普通光镜下双盲法读片，观察判断细胞因子TGF-β1在银屑病皮损和正常皮肤切片组织上的表达定位。采用OLYMPUS BX51显微镜，DP Manager图像采集软件和Image-proplus 6图象分析软件进行定量分析，随机选取每张切片5个视野(10×40倍)测定阳性细胞的累及光密度 (IOD值)及面积(area)，以IOD/area值表示TGF-β1相对含量，其值越大表示抗原含量越高。

1.3 统计学方法 使用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。资料服从正态分布时，采用t检验或方差分析；资料不服从正态分布时采用t’检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β1在皮肤组织中的定位表达 在正常皮肤组织中，TGF-β1主要在表皮基底细胞中表达，在表皮棘层细胞及真皮中通常无表达或低表达；在银屑病组皮损组织中，可见表皮层明显增厚，真皮毛细血管增生，在增厚的表皮细胞中TGF-β1通常仍是无表达或低表达，其中在基底层细胞中的表达与正常皮肤组织相比明显下调，但在真皮乳头层有明显表达；在空白对照组中TGF-β1在表皮、真皮区均无表达，见图1。

图1 TGF-β1(1：150)在皮肤组织中的表达(SP，×400) a：寻常型银屑病组；b：红皮型银屑病组；c：脓胞型银屑病组；d：正常皮肤组；e：空白对照组

2.2 TGF-β1在皮肤组织中的定量表达 银屑病组TGF-β1表达量高于正常皮肤组，红皮型银屑病组、寻常型银屑病组及总银屑病组的平均光密度均值高于正常对照组，差异有统计学意义(P< 0.05)，脓胞型银屑病组与正常对照组之间、三亚组间两两比较，差异均无统计学意义(P> 0.05)，见表2。

表2 TGF-β1在各组皮肤组织中的表达

a：红皮型亚组与寻常型亚组比较；b：红皮型亚组与脓胞型亚组比较；c：寻常型亚组与脓胞型亚组比较

3 讨论

TGF-β家族是一类广泛存在于多个组织，具有多种调节功能的细胞因子，参与细胞增殖、分化、迁移、凋零、炎症反应、血管增生等多种细胞活动。TGF-β分为三个亚型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)，它们功能相似，其中TGF-β1为主要存在形式[2]，活性也最强。TGF-β1/Smads信号通路为其主要信号传导方式，TGF-β1首先与TGF-βR结合，激活细胞内Smad2-3磷酸化，被活化的Smad2-3与Smad4形成复合体，然后进入到细胞核，参与调节靶基因转录。TGF-β1/Smads信号通路中，Smad2-3作为TGF-β1的下游细胞因子，Smad4则是Smad2-3进入细胞核的桥梁，而Smad6-7则发挥负向调节功能[3]，这被称为典型通路。近年来也有文献报道，除经典通路外还存在MAP激酶途径等多种非典型信号通路[4]。TGF-β1在体内分布广泛，能通过自分泌、旁分泌及内分泌形式到达靶组织[5，6]，发挥生物学效应。

关于银屑病的发病机制，目前认为IL-23/Th17通路在其中起着至关重要的作用，IL-23能调节表皮增生、棘层增厚、过度不全角化及正型角化过度；Th17细胞自原始T细胞分化而来，能依次产生前炎症细胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22及IL-26，刺激角质细胞使其异常增生，并进一步产生前炎症细胞因子、趋化因子、抗菌肽，刺激炎症区的其它免疫细胞，促使炎症进一步发展，除参与炎症反应，Th17细胞也在血管生成过程中扮演重要角色；IL-23是Th17细胞的上游刺激物，有促进Th17细胞的发育及维持其功能的作用。TGF-β1是IL23/Th17轴中重要的介质，其作用是促进IL-23受体表达，以及促进Th17细胞的分化[7，8]。同时作为炎症介质参与炎症细胞浸润，TGF-β1作为一种重要的炎症介质，根据所处环境不同，有促进炎症和抑制炎症双重的作用[9]。银屑病主要病理表现为表皮增生、血管扩张及增殖及炎症细胞浸润，TGF-β1在上述病理变化中都能起到调节作用[10，11]。

本实验中，TGF-β1在银屑病表皮基底层细胞中表达明显下降。表皮基底层细胞具有较强的增殖能力，增殖的细胞可进一步发生分化，然后补充凋亡的表皮细胞并调控表皮层厚度。这提示TGF-β1具有抑制基底细胞增殖的作用，此结论与细胞体外培养实验的结果相符，体外细胞培养发现TGF-β1抑制表皮细胞增殖[12]。但在动物实验中，通过转基因技术得到一种TGF-β1在表皮基底细胞中表达增强的小鼠模型，即角蛋白5-转化生长因子-β1(K5-TGF-β1)转基因小鼠，其皮损中同时观察到TGF-β1表达增强及表皮增生，并伴有其它一些类似银屑病的病理表现[12]，此现象与TGF-β1抑制细胞增殖的功能相矛盾。这可能是皮损处炎症反应中的其它因子(如TNF-α、IL-17、IL-22等)发挥了促进表皮细胞增殖的作用，并且其强度超过了TGF-β1对表皮增殖的抑制作用，导致虽然表皮中TGF-β1表达增强，但病理上仍表现为表皮增生。用肿瘤坏死因子拮抗剂治疗K5-TGF-β1转基因小鼠，当炎症控制后，表皮增殖减轻[2]，一定程度上支持了上述推测。另外，本实验还观察到，通常情况下，TGF-β1由表皮基底层细胞分泌，真皮乳头层不分泌或极少分泌，故考虑：银屑病皮损处真皮乳头层中TGF-β1表达增强可能是由于在某些因素刺激下表皮基底层细胞中的TGF-β1大量通过旁分泌形式进入导致。由于基底细胞中TGF-β1大量外流，引起TGF-β1代偿性分泌增强，故皮损中总TGF-β1表达量是上调。而进入真皮乳头层的TGF-β1则成为一种炎症介质，参与炎症反应，促进皮损区炎症细胞的浸润。若此假设得到进一步实验的证实，则能为药物开发提供另一种思路，即开发一种能抑制TGF-β1从基底层细胞进入周围组织并有一定的抗炎作用的药物，或许能在银屑病的治疗上取得比TGF-β1拮抗剂更好的疗效。故进一步深入研究TGF-β1在银屑病发病机制中的作用对治疗银屑病有重要指导意义。银屑病依临床表现可分为寻常型、红皮型、脓胞型和关节型，关节型伴有关节病变，皮肤表现与其它类型银屑病相同。寻常型银屑病的病理表现为角化过度伴角化不全，角化不全区可见munro微脓肿，颗粒层明显减少或消失，棘层增厚、表皮突整齐向下延伸，乳头层上方棘层变薄，毛细血管扩张并迂曲，周围可见淋巴细胞、中性粒细胞浸润，红皮型和脓胞型的病理表现与寻常型基本相同，其中红皮型真皮浅层血管充血扩张更明显，脓胞型可见kogoj微脓肿。此实验中银屑病各亚型间TGF-β1表达无统计学差异，提示TGF-β1表达量银屑病类型无关，不能证明TGF-β1能调控银屑病真皮浅层毛线血管扩张程度与kogoj微脓肿形成。脓胞型银屑病组TGF-β1表达较正常组增强，但无统计学意义，可能与标本量较小有关。以后可进一步扩大样本量，并在此基础上依据银屑病皮损的严重程度再进行分组，了解与银屑病严重程度之间的关联性。另外，银屑病的发病是多种细胞因子共同参与调控的结果，所以单个细胞因子的转基因小鼠模型(如K5-TGF-β1、K5-STAT3、K14-AREG等)都有类似银屑病的皮肤表现，但都不能达到很令人满意的程度[14]，进一步弄清TGF-β1与其它细胞因子协同作用机制，才能对银屑病有更全面的认识，对提高银屑病的诊治水平有一定的帮助。

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Expression of TGF-β1in psoriatic skin tissue

BAIYang1，2，LIJiang-tao1，WANGLin3
(1.DepartmentofRheumatologyandImmunology，TheFirstPeople’sHospitalofYibin，Yibin644000，China；2.NorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637000，China；3.DepartmentofDermatology，WestChinaHospital，Chengdu610000，China)

LIJiang-tao

Objective To investigate the role of TGF-β1in pathogenesis of psoriasis in order to provide a theoretical basis for the treatment of the disease.Methods By immunohistochemistry (IHC) SP assay，TGF-β1expression was determined in skin tissues obtained from patients with psoriasis vulgaris (n= 19)，pustular psoriasis (n= 20) and erythrodermic psoriasis(n= 19)，as well as normal skin tissues (n= 10)，and compared among the groups.Results In normal skin tissue，the expression of TGF-β1was located in the basal layer of epidermis，and the expression was weak or absent in the stratum spinosum of epidermis and the papillary layer of dermis.In psoriatic lesions，the expression of TGF-β1was located in the papillary layer of dermis but the expression was weak or absent expression in the epidermis.Quantitative analysis revealed that IOD/area was significantly higher in the psoriasis groups than that in normal group (P< 0.05).However，no significant difference among the three sub-types of psoriasis was detected (P> 0.05).Conclusion The abnormal expression of TGF-β1may play an important role in pathogenesis of psoriasis.

TGF-β1；Psoriasis；Immunohistochemistry；Cytokine

四川省卫计委科研基金资助项目(编号：110599)；宜宾市科技局科研基金资助项目(编号：2012SF004)

李江涛

R758.63

A

1672-6170(2015)06-0040-04

2015-04-09；

2015-08-28)