LA－ICP－MS分析校正策略研究

吴少尉，张梦兰，王 蒙，张秀焕

（湖北民族学院化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000）

LA－ICP－MS分析校正策略研究

吴少尉，张梦兰，王 蒙，张秀焕

（湖北民族学院化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000）

激光剥蚀电感耦合等离子体质谱分析技术（LA－ICP－MS）以其原位、实时、快速的分析优势，已广泛应用于地质、材料、冶金、考古、医药和生物等领域.除了分析仪器的硬软件研究外，校正分析方略研究一直是LA－ICP－MS元素作图成像分析中的重中之重，尤其是标样的合理制备和使用.就以上各方面做出详细的述评，明确LA－ICP－MS联用分析技术的未来发展方向.

LA－ICP－MS；校正策略；元素作图；标样制备

激光剥蚀（laser ablation，LA）和电热蒸发（electrothermal vaporation，ETV）等固体微量进样技术是电感耦合等离子体原子发射光谱／质谱分析（Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry／Mass Spec⁃trometry，ICP－AES／MS）中的重要进样手段.固体直接进样很好地避免了湿法消解过程中存在的操作繁琐、加热蒸酸耗时长、挥发性元素易损失和容易造成污染等缺点.作为样品的蒸发气化单元激光剥蚀（LA），因为蒸发气化进样过程与激发／电离分析过程是分开进行的，故更有利于各个相关实验条件的设定优化.LA－ICPMS联用分析技术拥有高的空间分辨率（5～150μm）、高的灵敏度和样品通量、多元素同时检测等优势，是实际样品中元素分布作图显像（imaging）分析强有力的工具.近年来国内外分析家在众多领域开展了许多深入细致的研究工作，本文就此做出详细的述评，与读者们交流学习，明确LA－ICP－MS联用分析技术的未来发展方向.LA－ICP－MS在同位素地球化学和年代学领域得到了大量应用，可在同一位置上获得锆石U－Pb年龄和Hf同位素年龄分析［1］数据.该技术还可定量测定流体包裹体中常量和微量元素的含量，为成矿流体研究提供古流体组成的物理化学信息.中国地质大学高山教授课题组对LA－ICP－MS在地质样品中元素及同位素微区地球化学分析应用做了系统研究［2－4］.钢铁研究总院王海舟教授课题组对LA－ICP－MS在钢铁、有色金属及半导体等材料科学领域中的元素分布及涂层深度、表面微区分析应用进行了较全面研究［5－7］.清华大学张新荣教授课题组通过“三明治”型免疫反应，Sm3＋标记甲胎蛋白，Eu3＋标记癌胚抗原，Au纳米颗粒标记人免疫球蛋白，利用LA－ICP－MS手段，检测了免疫微阵列芯片斑点中三个蛋白质，并很好地将其建立为微阵列信息读出的新方法［8］.马栋等［9］对38种车辆油漆样品采用LA－ICP－MS进行测定分析，结果有30种可直接依据所含金属元素种类的差异对其进行区分认定，其余8种依据元素间响应值比值的差异进行区分.方法重现性良好，精密度RSD小于10%，所建立的方法对样品微损，适用于法庭科学对车辆油漆的甄别检测.德国Becker［10］课题组利用LA－ICP－MS分析了人脑多形性胶质细胞瘤组织Cu、Pb、Zn和U的成像分布情况.结果表明脑瘤组织中Cu和Zn的分布区域相似，在瘤内溶血部分.英国McLeod［11］课题组使用LA－ICP－MS技术对阿尔茨海默氏病鼠脑部免疫组织中Mg、Al、Ca、Fe、Cu和Zn的分布分析，并以Ni和Eu的抗体络合物去标记并间接测定分析免疫组织血小板中β淀粉质蛋白.Konz等［12］研究分析人眼前部组织结构（角膜，睫毛体，虹膜）中Mg、Fe和Cu的异质分布，建立LA－ICP－MS研究临床眼病中金属元素分布及变化的方法.Re⁃ifschneider等［13］切取经过顺铂治疗的人食管瘤组织样本，部分样用苏木色精（结构中含铝）和曙红（含溴）齐染色，部分样未染，最后借助LA－ICP－MS技术对瘤组织中C、Al、Br、Pt做元素分布成像分析，对于染色样和未染色样获得了相似的Pt分布图像.组织染色靶点复杂化后，也获得了Pt元素完整分布图，光学显微图与元素分布图也基本对上得到了相互印证病灶.针对向日葵叶片中常量和微量元素的分布情况，Koetschau等［14］用LA－ICP－MS技术研究分析，归纳出四种分布方式：①Cd、Ce、Cu、La、Mn和Zn聚集在叶脉；②更高含量的Fe和S聚集叶尖；③K和Ni优先富集于叶肉组织；④Ca、Cr和P表现出均匀地分布于整个叶面上.Austin等［15］对热液转化地珊瑚羟磷灰石医用搭架材料中Sr和Mg的分布图进行LA－ICP－MS绘制，更好地了解生物医用材料在组织移植中的相互融合作用及影响.对于由磷灰石、角闪石、斜长石聚集的多相矿物辉长岩地质样品，Paul等［16］采用LA－ICP－MS技术对各相中元素的分布图精确测绘出，并归属出了图像像素区域所对应的矿物相.Galiová等［17］借助LA－ICP－MS对一块棕熊化石牙进行Ca、P、Ba、Sr、Zn元素成像考古分析，通过Sr、Zn含量及其Sr／Zn比的变化来推断熊生前的迁移和饮食情况，基于轻质同位素及Sr／Zn和Sr／Ba比的变化来关联季节影响和推断其饮食成分.Marie等［18］也用LA－ICP－MS分析灰熊毛发中Hg、Cu、Cd、Pb、Fe和Zn含量来评价其饮食情况，表明发干中Hg、Cu、Zn的含量与其摄入的鲑鱼间存在明显相关性.

纳米技术的蓬勃发展及其纳米材料的广泛应用，环境中纳米颗粒物的分布随之剧增.LA－ICP－MS技术目前也已很好地用于纳米颗粒物分析：Yan等［19］通过乙酰丙酮／丁醇／三乙胺（6∶3∶1，v／v）混合液做流动相薄层色谱分离金离子水性悬浮体中金纳米颗粒，并以磷酸盐缓冲溶液（0.2 M，pH6.8），TritonX－114（0.4%，w／v）和EDTA（10mM）混合液做流动相分离13、34和47 nm尺寸的金纳米颗粒并联用LA－ICP－MS检测定量.得到好的重现性和低至皮克级检出限.Boehme［20］应用LA－ICP－MS研究大型溞和斑马鱼胚胎中吸收纳米颗粒物Al2O3、Ag和Au的情况表明，这些纳米颗粒物附着于斑马鱼胚胎的绒毛膜上和并入到溞的肠道内.但由于标样制备均匀性的欠缺致使定量回收率不理想.

LA－ICP－MS以其原位（in situ）、实时（real time）、快速的分析优势，已广泛应用于地质、材料、冶金、考古、医药和生物等领域.由于LA－ICP－MS在分析过程中激光连续轰击的重复性问题，固体样品的均匀性、物理化学性质和表面状态等因素也影响采样过程中的重复性，同时，定值固体标样的缺乏且其研发相对滞后等，都对分析结果的准确度和精密度带来了不确定度，所以，除了分析仪器的硬软件研究外，校正分析方略研究一直是LA－ICP－MS元素作图成像分析中的重中之重，尤其是标样的合理制备和使用.借助标准溶液来直接校准LA－ICP－MS固体样品分析结果非常困难，ICP内管结构改为双气路进样外，还需用干气熔胶和湿气熔胶中元素不同响应信号［21］的校正因子来换算.绝大多数的标样研制还是在固体形式上，表现为以下6种形式.

1 生物鉴定参考物质压片

比如利用几百毫克的龙虾肝或胰脏、狗鱼肝或肉参考物质［22］在15个大气压下压制5 min制片，然后附着在载玻片上LA－ICP－MS来定量鼠脑组织中Cu、Zn和Fe的含量，这种校正方法的不足是压片过程中空气可能会潜入形成微洞，以致质荷比m／z56的ArO＋会干扰Fe的定量.

2 溶胶－凝胶组织薄片（胶囊）

溶胶－凝胶工艺可以看成溶胶制取，溶胶凝结及溶剂去除来制备硅胶玻璃材料过程.一般以有机硅氧烷水解形成溶胶颗粒，生长聚合成链，进而积聚成立体网状结构而保存流体成凝胶.加入一定的酸或碱可以催化凝胶形成过程.不同浓度（或浓度比）的目标分析元素和内标元素同时［23］添加入，振摇混合均匀，然后把混合液注入一定模具中，用穿孔的保鲜膜封盖上，控制蒸发速率，充满凝胶的模具每天称重，直到其质量不在变化而保持恒定后，即可认定为制备成干凝胶标样.也可以在溶胶－凝胶溶液制取后，添加一定量研磨均匀的生物组织样品［24］（如预先加入了不同量目标元素的鼠脑），然后手动振摇混合均匀后注入一定模具中，膜封，室温下风干至恒重，制备基体匹配的生物标准样品.这种制标校正方法耗时比较长，至少一周时间，有时共存的目标元素不能太多，有沉降的风险影响定量值.

3 琼脂糖（琼脂凝胶）、明胶膜制备标样

琼脂糖［25］投入醋酸钠缓冲液中，不同量的多元素标准溶液一并加入，随后加入蒸馏水定容，放在80～90℃水浴上摇动助琼脂均匀分散混合，移取小部分热琼脂糖混合液于预先水平放置的干净载玻片上，在洁净条件下慢慢放置冷却，干燥，直到玻片上粘附一层厚约30μm的琼脂糖均一薄膜而成.明胶膜标样制备主要是基于明胶易得、无毒、便宜，能够提供类似于生物组织的软薄片基体，目标分析物能够均匀分布其中.如制备时，移取不同体积含Pt抗癌药物［26］或含Br抗肺结核药物［27］储备标液，用10%（W／V）的明胶溶液稀释到要求的目标分析物浓度范围，然后抽吸一定体积的稀释液放在平置的载玻片上，慢慢放置让其干燥硬化成膜制标.

4 元素加标聚合物薄膜标样

其制作流程是：依次用丙酮、5%硝酸、去离子水清洗干净6～7cm2石英载玻片，放在旋转处理器夹盘上，配制含10%聚甲基丙烯酸甲酯、40%间二甲苯、50%氯苯的溶液，并加入不同浓度的有机金属标准溶液［28］，混匀形成涂敷溶液，移取200μL于载玻片上，静置10s，在4000转速下均匀旋涂40s后，取出放在130℃热板上烘干而成.均匀处理的生物软组织冷冻切片覆盖在载玻片涂层上共同剥蚀分析.制标连同制样耗时较长.

5 组织匀浆元素加标制备

这类标样制备方法实际上是带样品基体制作方式.使用基体匹配的标样，尽可能平衡基体效应，相当于标准加入法定量.首先把分析对象样品如人脑［29－30］、鼠脑［31］、脑瘤肿块［32］等捣碎研磨均匀，匀浆均分转移到安培瓶中，再把配制的目标元素标准溶液按照一定梯度的浓度量分别加入，或者按照接近样品中本底值量［33－34］（预先初测）对等地加入混匀.随后将加标匀浆放在液氮中冷冻保存，分析检测时，在低温冷浴中切成几十微米厚的薄片标样.组织匀浆元素加标制备方法，精炼操作要求高，低温制样设备多，样品制备耗时长，偏重在个案样的校准上，不适合批量样的校准定量.

6 平面打印制标方式

利用喷墨打印机在纸面上或者薄膜平面上来印制分析物模型标样.英国Fernandez［35］课题组在A4平面纸上，用含一定浓度铜的青蓝墨水打印一些圆点状、线状或小条状样式的“样品”.设置不同的相对颜色密度（或图案透明度）打印，得到不同含量的标样带，精确切取标样带消解后，溶液雾化ICP－MS分析结果和标样带经过LA－ICP－MS直接分析线性响应相一致，目标分析物铜的浓度与图案透明度线性相关.借此方式来探索生物组织切片中元素的分布及定量分析.德国Simone课题组［36］通过SDS－PAGE电泳分离牛血清蛋白、卵清蛋白、溶菌酶等模型蛋白，经过电吸转染到0.45 μm孔径的硝化纤维素膜上，与稀土金属标记的抗体免疫反应后清洗风干纤维膜.然后把添加了一定浓度目标分析元素的特定墨水按不同密度打印在蛋白质印迹的纤维平面膜附近来制标准样系列.再在整张硝化纤维平面膜上，用含一定浓度内标元素的墨水打印覆盖一层内标，这样通过墨水打印在相同基底硝化纤维平面膜上来印制标样和样品.LA－ICP－MS测定的线性关系相似于“标样”准确剪切下来消解处理后以SN－ICP－MS测定的线性相关性，相关系数大于0.999.过程如图1和图2（引自Royal society of chemistry，JAAS.2014，29（7））所示.

实际上，在研制标样时，人们不仅仅注意标样和样品的物质组成基体匹配，还要注重样品在理化性质（如密度、强度）、空间结构形式等各个方面的充分匹配，达到“准样品”的标样制备，那么分析结果的精密度和准确度将会得到极大改善.总之，针对不同属性样品的基体匹配标准品的研制及其基体效应、元素分馏效应的研究仍为未来研究的重点；在高分辨率条件下，多信息融合对天然样品中金属组学的研究方兴未艾；加强LA－ICP－MS分析技术与色谱分离手段的联用分析来快速解决复杂体系中元素的化学形态分析.

本文感谢国家自然科学基金研究课题（21565013）“基于3D打印标样制备LA－ICP－MS原位分析富硒食品”资助！

图1 蛋白质印染转移免疫分析流程示意图：（1）：以两个样品通道分离蛋白质，标示A道蛋白质和未修饰B道蛋白质相配为抗原；（2）：电泳转移印迹；（3）：标示抗体和其各自抗原间的免疫反应示意图.Fig.1 Schematic workflow of the Western blot immunoassay：（1）：the protein separation scheme with its two sample lane taggedproteins（lane A）and an unmodified protein（lane B）suitable as antigens；（2）：electro－blotting；（3）：scheme of the immunoreaction be⁃tween tagged antibodies and its respective antigens.

图2 校准方案（1）和内标（2）.实验蛋白质电吸转染在纤维膜上的原理证明.免疫反应后，一系列的校准标准物（1）用墨水II以不同的打印密度打印为小方格.在第二步（2）内标，用墨水I以20%的密度打印在整个膜上面（标记为黄色区域）.Fig.2 Scheme of calibration（1）and internal standardization（2）.For the proof of principle experiment proteins are electro blotted onto a membrane.After immunoreaction a series of calibration standards（1）are printed with Ink II in squares with varying printing densities.In the second step（2）the internal standard is printed with Ink I at 20%density over the entire membrane（marked as the yellow area）.

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责任编辑：高 山

Study of Calibration Strategy for LA－ICP－MS

WU Shaowei，ZHANG Menglan，WANG Men，ZHANG Xiuhuan
（School of Chemistry and Environmental Engineering，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China）

The laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry（LA－ICP－MS）hyphenate technique was applied in geological，material，metallurgical，archaeology，biological，and medicine fields with its prominent advantages such as：in situ，real time and rapidly analysis.It is a modern and powerful analytical tool for the mapping of elemental distribution in samples.And it is urgent that study of calibra⁃tion strategy for LA－ICP－MS besides developing hard and soft ware of analytical instrument，especially for the preparation and utilization of standard samples.The above various aspects of LA－ICP－MS were re⁃viewed in this paper for the communication with readers.The future trends of LA－ICP－MS hyphenate an⁃alytical technique will be understood.

LA－ICP－MS；calibration strategy；elemental mapping；preparation of standards

O657.31

A

1008－8423（2015）03－0321－05

10.13501／j.cnki.42－1569／n.2015.09.024

2015－08－26.

国家自然科学基金项目（21565013）.

吴少尉（1973－），男，博士，副教授，主要从事原子光质谱分析及其联用分析技术研究.