单糖柱前PMP衍生HPLC测定方法探讨

朱照武，庄 洋，向春林，赵 娜，李 珊，向玲芳，莫开菊∗

（1.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室（湖北民族学院），湖北 恩施 445000）

单糖柱前PMP衍生HPLC测定方法探讨

朱照武1，2，庄 洋1，2，向春林1，2，赵 娜2，李 珊1，2，向玲芳1，2，莫开菊1，2∗

（1.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室（湖北民族学院），湖北 恩施 445000）

从PMP萃取酸度、萃取次数探讨了柱前PMP衍生方法对单糖－PMP衍生物的影响，并从流动相比例、缓冲液pH值、缓冲盐浓度三个方面对单糖柱前衍生HPLC的分离效果进行了优化研究.结果表明：单糖进行PMP衍生后，用HCl中和至pH为7.0，能最大限度避免单糖－PMP衍生产物的损失；使用三氯甲烷萃取PMP三次时，能在除去PMP的情况下避免单糖－PMP衍生产物的损失；降低流动相中有机相的比例或提高缓冲液的pH值，有利于色谱峰分离度的提高；提高缓冲盐浓度，有利于保持色谱峰的对称性.

单糖；PMP衍生物；高效液相色谱；分离度；不对称因子

多糖类物质广泛存在于自然界中，近年来，我国对植物多糖展开了广泛的研究，植物多糖的药理活性是研究的重点［1－4］.多糖是由单糖通过糖苷键连接而成的，多糖的单糖组成作为一级结构的主要内容，自然成为研究多糖生物活性的基础［5］.糖类物质因不具有发色基团不能直接使用紫外和荧光检测而限制了分析手段的应用，自1989年Honda等［6－8］首次在弱碱性条件下成功实现PMP糖类衍生，使糖类被标记上紫外吸收基团，具有强烈的紫外吸收，糖类的分析方法就得到快速发展.其中，PMP柱前衍生化HPLC分析成为糖类分析的重要方法.杨兴斌等［9］建立了当归多糖单糖组成的PMP柱前衍生化HPLC方法，Lv等［10］利用PMP柱前衍生化HPLC法分析出绿茶多糖由甘露糖、木糖、阿拉伯糖等9种单糖组成.

尽管PMP在糖类检测方面具有优越性，但是糖类－PMP衍生方法仍存在一定不足.有报道指出，PMP衍生产物易丢失1分子PMP，且PMP试剂的疏水性偏低，多次萃取难以完全去除，萃取过程也会引起部分样品的损失［11］.Castells［12］也报道过PMP萃取过程会导致衍生产物的损失.此外，戴军［13］对三氯甲烷萃取时溶液的酸度进行研究，发现溶液偏碱性时衍生产物在三氯甲烷中有一定的溶解度，会造成损失，这与Strydom［14］的研究结果一致；若萃取时溶液偏酸性，衍生产物不稳定，也会造成结果偏低.

单糖种类繁多，许多植物多糖的单糖组成复杂，经常需要调整液相色谱条件使各种单糖衍生物的色谱峰达到完全分离.在色谱柱固定的条件下，色谱峰的分离效果很大程度取决于流动相，因此，了解流动相对色谱峰分离效果及峰形的影响有利于在不同条件下获得良好的单糖衍生物色谱图.

本文从单糖的PMP衍生方法及衍生产物的HPLC分离两个方面进行探讨，为单糖柱前PMP衍生HPLC方法的优化提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

D－甘露糖、D－半乳糖、L－鼠李糖、L－阿拉伯糖 德国Dr.Ehrenstorfer公司；D－葡萄糖、L－岩藻糖 美国sigma公司；1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）、D－葡萄糖醛酸、D－半乳糖醛酸 国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈 色谱纯 美国TEDIA天地试剂公司；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、三氯甲烷均为国产分析纯 国药集团化学试剂有限公司.

1.2 仪器与设备

P680 ALPG高效液相色谱仪，包括DAD－100检测器、TCC－100柱温箱和Chromeleon色谱工作站（戴安中国有限公司）；MS1 Minishaker漩涡混合器（德国IKA公司）；GZX－9140 MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）.

1.3 方法

1.3.1 单糖的衍生 分别配制一定浓度的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及岩藻糖的单糖标准溶液和混合标准溶液.各标准溶液分别取50 μL置于5 mL的具塞试管中，各加50 μL 0.6mol／L的NaOH溶液，漩涡混匀；再加100μL0.5mol／L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，在70℃的烘箱中避光反应100min，取出避光放置10min冷却至室温，加一定量的0.3 mol／L的HCL，加水至2 mL，再加2 mL的三氯甲烷，漩涡混匀，静置，弃去三氯甲烷相，如此萃取几次.将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进行分析.

1.3.2 高效液相色谱分析 色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：A液：0.1mol／L的pH6.7磷酸钾盐缓冲液，B液：乙腈；柱温：30℃；检测波长：250 nm；流速：1 mL／min；进样体积：20μL.

1.3.3 萃取酸度对PMP衍生产物的影响 衍生反应结束后，待混合标准液冷却至室温，分别加入80、90、100、110、120μL 0.3mol／L的盐酸，加水至2mL，同1.3.1法萃取、过0.45μm微孔膜后进行HPLC分析.

1.3.4 萃取过程对PMP残留及衍生产物的影响 样品按1.3.1衍生中和后，加入三氯甲烷，漩涡混匀10s间隔5s，重复3次后，静置，弃去三氯甲烷层，如此分别萃取1、2、3、4、5次.样品过0.45μm微孔膜后进行HPLC分析.

1.3.5 流动相比例对单糖衍生物的分离度影响 混合标准单糖溶液进行PMP衍生后，分别在流动相比例为A液∶B液＝80∶20、81∶19、82∶18、83∶17的条件下进行HPLC分析，比较色谱峰的分离度R．

1.3.6 流动相pH值对单糖衍生物的分离度影响 分别配制pH为6.5和6.7的0.1 mol／L的磷酸钾盐缓冲液为A液，以最佳流动相比例对单糖衍生物进行HPLC分析，比较色谱峰的分离度R．

1.3.7 磷酸缓冲盐浓度对色谱峰对称性的影响 分别配制浓度为0.01、0.05、0.1mol／L pH6.7的磷酸钾盐缓冲液作为流动相A液，在最佳流动相比例下，对葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖四种单糖衍生物进行HPLC分析，比较色谱峰的不对称因子As．

2 结果与分析

2.1 萃取酸度对PMP衍生产物的影响

PMP衍生结束后，加入HCl中和，在中性条件下，利用三氯甲烷萃取出多余的PMP，保留单糖－PMP衍生产物.萃取时溶液环境偏酸或偏碱均会对单糖－PMP衍生产物造成影响，如表1，若溶液偏碱性，则单糖－PMP衍生物的峰面积低于完全中和时的测定结果，若中和过度，溶液偏酸性，单糖－PMP衍生物的峰面积也低于完全中和时的测定结果.总之，萃取时溶液偏酸或偏碱均会影响试验结果，这与戴军［13］的研究一致.

试验结果表明，萃取酸度对不同单糖衍生物的影响不同，对葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的PMP衍生产物的影响最大，对甘露糖和鼠李糖的PMP衍生物的影响最小.溶液呈中性时，八种单糖－PMP衍生物峰面积的总和最大.

2.2 萃取过程对PMP残留的影响萃取时，若PMP萃取不彻底，HPLC图谱中PMP峰明显，影响图谱效果；若PMP萃取过度，可能会造成单糖－PMP衍生产物的损失.分别对混合标准品的衍生液萃取1、2、3、4、5次后的结果如图

1和表2.

图1 三氯甲烷萃取次数对PMP的影响Fig.1 Effects of chloroform extrction times on PMP

表1 中和对萃取过程中单糖－PMP衍生物的影响Tab.1 Effects of neutralization before extraction on derivatives

三氯甲烷萃取一次时，溶液中单糖－PMP衍生产物的峰面积最大，但PMP残留严重，峰面积大于单糖－PMP衍生产物，当萃取次数达到3次时，PMP残留量较低，不影响图谱效果，萃取4次时图谱上已无明显PMP峰.

但随着萃取次数的增加，单糖－PMP衍生物的含量却逐步降低，萃取5次时，单糖－PMP衍生物的含量出现明显下降.因此，综合考虑单糖－PMP衍生物的保留、PMP的去除以及萃取工作量，选择萃取3次较合适.

2.3 流动相比例对单糖衍生物分离度的影响

在实验条件下，8种单糖衍生物的保留顺序依次为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖.四种流动相比例条件下，8种单糖衍生物的色谱峰分离效果如图2.

表2 三氯甲烷萃取次数对单糖－PMP衍生物的影响Tab.2 Effects of chloroform extrction times on derivatives

图2 流动相比例对色谱峰分离度的影响Fig.2 Effects of moblie phase ratio on seperation of peaks

由图2看出，pH6.7的缓冲液∶乙腈＝80∶20时，鼠李糖和葡萄糖醛酸衍生物的色谱峰完全重叠，且与半乳糖醛酸衍生物不能完全分离；随着缓冲液比例的提高，鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸衍生物色谱峰的分离度逐渐提高，当缓冲液比例提高到82%时，8种单糖衍生物达到完全分离；继续提高缓冲液比例至83%时，分离效果进一步改善.4种流动相比例下，各单糖衍生物色谱峰的分离度R如表3，提高缓冲液比例降低有机相比例时，色谱峰的分离度R提高，但保留时间延长，流动相比例为83∶17时，样品运行时间长达50 min.因此，选择刚好能使八种单糖衍生物完全分离的流动相比例，即pH6.7磷酸缓冲液 ∶乙腈＝82∶18.

2.4 缓冲液pH值对单糖衍生物分离度的影响

色谱柱使用一段时间后，柱效降低，流动相比例为pH6.7的磷酸缓冲液 ∶乙腈＝82∶18时，鼠李糖与半乳糖醛酸的分离度R下降，不能完全分离.在保持流动相比例不变的条件下，降低缓冲液pH，八种单糖衍生物的分离效果如图3.

表3 流动相比例对色谱峰分离度R的影响Tab.3 Effects of moblie phase ratio on seperation of peaks

图3 缓冲液pH值对色谱峰分离度的影响Fig.3 Effects of pH on seperation of peaks

在本试验条件下，将磷酸缓冲液的pH从6.7降低到6.5，能显著改善鼠李糖和葡萄糖醛酸衍生物的分离效果，达到完全分离，但同时样品分离时间延长.两种pH条件下，八种单糖衍生物的分离度R如表4，pH6.5条件下各色谱峰的分离度R几乎均大于pH6.7.因此，降低磷酸缓冲液的pH，有助于提高色谱峰的分离效果.

2.5 缓冲盐浓度对色谱峰的影响

分别使用盐浓度为0.01、0.05、0.10mol／L的pH6.7磷酸钾盐缓冲液作为流动相A液，对葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖四种单糖衍生物进行HPLC分析，比较不同缓冲盐浓度对色谱峰不对称因As的影响．结果如图4和表5，在实验范围内，缓冲盐浓度越高，不对称因子As越小，峰形越好.当盐浓度为0.01 mol／L时，色谱峰的不对称因子As均高于1．4，明显拖尾；当盐浓度为0.05mol／L时，色谱峰的不对称因子As有所降低，色谱峰对称性提高；当盐浓度为0.10mol／L时，色谱峰的不对称因子As在1．05～1．2之间，对称性较好．

表4 缓冲液pH值对色谱峰分离度的影响Tab.4 Effects of pH on seperation of peaks

图4 不同缓冲盐浓度下的色谱峰图谱Fig.4 Effect of buffer concentration on asymmetry factor of peaks

3 结论与讨论

本文研究了单糖衍生方法的中和、萃取过程对单糖－PMP衍生物的影响以及流动相对HPLC色谱峰的影响，结果表明：

1）衍生结束后使用HCl完全中和，可以避免单糖－PMP衍生产物的损失.

可能是由于单糖－PMP衍生物含有碱性基团，易在碱性条件下随三氯甲烷萃取损失，而在酸性的环境中不稳定，其原因需进一步研究确认.

2）使用三氯甲烷萃取PMP时，萃取多次可以显著降低PMP的残留，但在中性条件下萃取，仍然会造成单糖－PMP衍生产物的损失.选择萃取3次，能较好平衡PMP去除和衍生产物保留的关系.

3）降低流动相中有机相的比例或降低缓冲液的pH值，均能提高单糖衍生物色谱峰的分离效果；提高缓冲盐浓度，能改善色谱峰的峰形，防止拖尾.

使用磷酸缓冲液作为无机相时，为保持峰形对称，需要较高的盐浓度，而高浓度的盐溶液对液相色谱系统和色谱柱均不利，有研究表明使用低浓度的乙酸铵盐溶液也能得到对称性好的色谱峰［15－17］，因此，应考虑使用乙酸铵盐或寻找其他的缓冲体系替代磷酸缓冲盐.实验中样品不同浓度会影响色谱图响应值.

表5 不同缓冲盐浓度下的色谱峰不对称因子AsTab.5 Effects of buffer concentration on asymmetry factor of peaks

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责任编辑：高 山

Research on the Method of PMP Pre－column Derivation of Monosaccharides by HPLC

ZHU Zhaowu1，2，ZHUANG Yang1，2，XIANG Chunlin1，2，ZHAO Na2，LI Shan1，2，XIANG Lingfang1，2，MO Kaiju1，2∗
（1.School of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China；2.Key Laboratory of Biologic Resources and Utilization of Hubei Province（Hubei University for Nationalities），Enshi 445000，China）

This article discussed the impact of PMP pre－column derivation on monosaccharide derivatives from extraction pH and extraction times.Moreover，the influence of mobile phase on the HPLC chromato⁃graphic peaks also have been studied from the ratio of mobile phase，the pH of buffer and the concentra⁃tion of buffer.The results indicated：Neutralized the derivation liquid with HCl to pH7.0 could avoid the loss of derivatives products to the utmost.Extracting three times by chloroform could remove almost PMP and avoid the loss of derivatives.Reducing the ratio of organic phase or the pH of buffer could improve the seperation of peaks；the asymmetry factor of peaks could be maintained in the optimum range by increas⁃ing the concentration of buffer.

monosaccharides；PMP derivatives；HPLC；seperation；asymmetry factor

O657.72

A

1008－8423（2015）03－0337－05

10.13501／j.cnki.42－1569／n.2015.09.027

2015－05－19.

湖北省研究与开发计划项目（2010BBB016）.

朱照武（1989－），女，硕士生，主要从事林特食品加工与开发研究；∗

莫开菊（1965－），女，博士，教授，主要从事食品加工及天然产物化学的研究.