基于弥散圆的光学显微镜景深自动标定方法

崔 力，李长阳

（宁波大学 信息科学与工程学院，浙江 宁波 315211）

基于弥散圆的光学显微镜景深自动标定方法

崔 力，李长阳

（宁波大学 信息科学与工程学院，浙江 宁波 315211）

针对光学显微镜存在小景深且景深范围不易确定的缺陷，导致后续图像处理工作困难这一问题，提出了一种基于弥散圆的光学显微镜景深自动标定方法。控制步进电机z轴方向移动连续拍摄，保证载物台上圆点标定板从前离焦到后离焦定向移动；利用活动轮廓分割方法提取图片序列中的轮廓圆，再采用LBP算法对拍摄图片序列进行复合轮廓处理和跟踪；根据提出的算法统计图像序列中标定圆轮廓的真圆度与弥散圆面积数据并分析标定景深。理论表明，提出的算法可以在不同倍率下测定景深范围，实验结果证明，该算法可以根据序列图片较为有效地标定景深，对后续图像处理有重要意义。

景深；活动轮廓；LBP；真圆度；弥散圆

0 引言

视觉系统可应用于自动化的检测、测量以及控制。但这些操作精准的前提是建立在镜头景深范围内［1］。景深与光学成像有关。在理想化的射线光学中，每条射线收敛到一个点时为聚焦状态，实际中成像由于衍射和畸变会产生软边缘的模糊光斑，边缘分割的不稳定导致景深范围不易确定［2］。实际在固定焦距的条件下不同物距仍然可以出现清晰成像效果，清晰成像的距离范围称为景深（Depth-of-Field，DOF）。人们对景深有过初步的探讨，提到了一些方法近似估计景深或处理景深问题，然而更倾向于换一种思路解决景深问题。例如，“改进微透镜”、编码相机［3］、宽动态［4］、去模糊算法［5］等等。在医疗、工业、或是生物医学领域，景深对于观察观测都有着极大的影响［6，7］，但是在当前工业中，景深的测量大多选择人工干预或者更换器物的方式替代景深约束（如停留于人眼标定，或者用激光灰度扫描景深标定版进行标定），缺乏价格低廉的景深自动标定方法。

活动轮廓就是一种基于能量的图像分割方法，对特征描述、识别和理解等高层次的处理有着重大的影响［8］。利用能量密集度的活动轮廓模型定位COC边缘，使用LBP分割跟踪COC边缘，并LBP是机器视觉领域的一种分类特征，该算子对光照具有不变性，能够较好的提取出圆扩散失真的边缘，提升检测效果［9］。弥散圆（Circle of Confusion，COC）用于描述一个点与一个最大模糊光斑点的区别。因为其以能量扩散为表现形式，通过评价“最大容忍弥散圆”可以间接反映景深信息。所以，根据COC直径标定景深具有可行性。

1 光学显微镜景深自动标定方法

光学镜片都存在景深的限制。如图1所示，以一个矩形范围做景深示意图（实际情况略有不同）。调整显微镜物距可在景深范围内观测到清晰的物像，反之则是离焦模糊的图像。由此现象，控制步进电机从前离焦到后离焦等间隔连续拍摄，再根据本文活动轮廓及LBP分割跟踪算法得到序列图像的相关参数，即可由COC真圆度和COC面积自动标定出景深范围。

图1 显微镜平台组成示意图

1.1 算法设计

针对不同光照环境及震动噪声等等对于图片拍摄的影响，本文选取了基于能量的活动轮廓分割以及具有光照鲁棒性的LBP分割方法提取标定轮廓。算法流程如图2所示。

图2 DOF标定算法流程图

首先，选取圆点标定版，将其固定在显微镜载物台上，利用步进电机单向步进移动并连续拍摄标定图片序列；然后，对序列图片进行活动轮廓分割，并且用LBP做分割跟踪处理，统计标定参数列表；最后，根据参数列表，进行多阈值分析，判断标定图片序列轮廓的真圆度和COC面积，得到满足Ts（Ts＝Sbest－SL1＝Sbest－SL2）以及Δρ（真圆度偏差）的位置，L1，L2为临界阈值序列标签，通过计算可得到DOF。

1.2 活动轮廓

活动轮廓算法是一种基于能量的分割算法，对轮廓进行迭代运算，可以弥补光晕产生的毛刺干扰，更为精准的定位COC范围。简单的Sobel和Canny等边缘检测算子对能量信息不够敏感，而活动轮廓利用能量估计函数进行边界测定，保证了边界的稳定性。根据文献［10］中的全局能量拟合模型可见式（1）：

式中，outside（C1）与inside（C1）分别代表区域轮廓C1的内外边界。c1、c2是图像的2个亮度常量估计参数。式（1）的v｜C1｜为一个过拟合平滑约束的正则项，最终根据迭代得到标定圆的相应轮廓C1如图3所示。其中，图3（a）为经过1000次迭代后的最终边界轮廓收敛示意图；图3（b）为活动轮廓水平集的三维示意图，其x和y轴分布为图像的长宽，z轴为图像灰度反色归一化到区间（－50，50）的灰度图，并以颜色区分灰度值。

图3 基于能量的活动轮廓处理图

1.3 LBP分割

LBP模型为式（2）：

式中，（xc，yc）是中心像素，ic为亮度，ip是相邻像素的亮度。s（x）是一个符号函数，函数形式如式（3）：

LBP的基本思想是对图像当前像素和它邻域像素进行对比后的结果求和。以当前像素为中心，对相邻像素进行阈值比较，如果中心像素的亮度大于或等于相邻像素，则标记为“1”，否则标记为“0”。用二进制数字来表示每个像素，例如00011110。由于周围相邻8个像素，最终可能获取28个组合，该组合被称为局部二值模式，有时也称为LBP码。利用LBP抗光照干扰特性，对一些内部圆干扰进行图像处理，通过如下方式计算：

①将检测窗口切分为区块（cells，每个区块3x3像素）；

②区块中的每个像素，与其八邻域像素按照顺时针的顺序进行比较（左上、左中、左下、右上等）；

③中心像素大于某个邻域的，设置为1；否则，设置为0。最终获得一个8位的二进制数（通常情况下会转换为十进制数字），作为该位置的特征。

根据活动轮廓得到的轮廓C1，计算边界点的Manhattan距离DM作为初步计算：

再根据候选外边界点在各个方向出现的概率与内边界点q在邻域位置序列上对应值Dirq，对p、q两点的距离DM作出相应修正，如式（5）所示：

候选外边界点方向权值计算公式如式（6）：

式中，Dir是位置序列，以中心像素左上方为起点按顺时针走向8邻域计算方向权重。再根据C1和相应的权重计算内轮廓跟踪方向，得到相应轮廓C。图4为LBP分割跟踪处理图。

图4 LBP处理图

1.4 统计划分与景深计算

步进电机移动的过程中，因为精度问题，导致拍摄圆形标定板的定向漂移现象发生，所以文中选取单个圆形标定区域进行序列跟踪计算。由轮廓跟踪序列，对标定图像序列圆轮廓进行参数统计，进行真圆度分析与COC测定，再标定景深。景深与COC关系如图5所示，其中，δ为COC的直径。

图5 景深与COC的关系

根据景深的定义将景深计算问题转换成COC估计，以COC面积Sl作为一个全局能量约束，同时联合真圆度约束。由轮廓跟踪得到COC边界C，然后由C的图像空间信息计算出圆心Oi，再根据圆心Oi计算出序列图像的真圆度ρ，真圆度计算公式为：

式中，Rmax为以Oi为圆心轮廓Ci的最大圆半径；Rmin以Oi为圆心轮廓Ci的最小圆半径；Ri为周长Ci＝2 π R得到不同图像序列统计半径，ρ越接近1表示越接近解析圆。设定阈值Δρ＝0.85作为初始约束统计粗景深范围D1，再根据COC面积界限Ts进行二次约束，计算COC图像序列模糊边界标签L1与L2。其中，Ts为最大容忍COC面积Si与聚焦平面圆点面积Sbest的差值。最终，可以根据Ts对应的模糊边界标签值L1与L2以及步进长度s计算精景深范围D。

2 实验与结果分析

2.1 实验装置与设计

实验平台采用南京波长光电科技有限公司的ZOOM460N体视显微镜，载物台上放置一块圆点标定板，通过光路公用的物镜传送信息至顶部目镜；目镜直接通过转接口连接到由日本Watec公司生产的两个型号为902B摄像机，再通过USB采样得到每帧704×576大小的图像。

实验整体设计：利用圆点标定板，做单向等距移动拍摄，得到标定图片序列（实验中，拍摄了150张6 μm／step的图像序列），再对图像序列进行活动轮廓分割，并进行LBP分割跟踪，得到分析数据Rmax、Rmin、Ri与ρ。根据Δρ和Ts计算景深范围D。

2.2 结果分析

活动轮廓选用基于全局的能量分析，初始轮廓的选定不会对最终的收敛结果有较大影响，只会造成分割能量平衡时迭代终止次数不同，越接近实际轮廓的初始轮廓算法迭代次数越少。实验中选用了800次迭代为终止条件，图6（a）为输入图像；图6（b）为50次迭代步长的活动轮廓过程示意图；图6（c）为LBP分割跟踪边界。根据图6（c）轮廓得到相应序列图片统计，如表1所示。

图6 单个标定圆的处理图

表1 标定参数统计

表1中，L为对应的步进高度标签，ρ为不同L对应的轮廓真圆度，Ri为标定圆半径，Si为标定圆面积，Ci为标定圆轮廓长度，ρ＞Δρ与Si＞Ts标记为“1”，代表满足条件ρ＞0.85与Si＞Ts时的图像（若观测平台成像面与光轴的垂直度较高，可以提高真圆度ρ作为阈值限定），反之，标记为“0”。由COC直径定义，选取经验值δ＝0.1pixel为最大允许的模糊直径，根据数据提取Rmax＝17.316 1与圆面积公式Ts＝π（Rmax－δ）2计算得到景深DOF的界限阈值Ts＝931，即可利用式（8）计算景深；

其中，L1＝114，L2＝102，s为步进电机每次拍摄垂直方向的移动步长，测试环境中s＝6 μm，得到景深D＝72 μm。在Matlab测试平台下局部区域处理效果图如图7所示。图7（a）的横坐标是图像序列标签，纵坐标为真圆度数据，根据原始数据可得到其趋势线拟合二次方程为：y＝－0．000 04x2＋0．007 6x＋0.485 7，对应的相关系数R2＝0.504 5；图7（b）的横坐标也是图像序列标签，纵坐标为COC面积Si数据，根据原始数据可得到其趋势线拟合二次方程为：y＝－0．499x2＋10．864x＋343．96，对应的相关系数R2＝0.886 3。根据表1与图7拟合曲线方程分析可知：在当前实验平台下，震动移位干扰比较大，活动轮廓分割与LBP跟踪得到的轮廓不呈现光滑曲线的特性，但是真圆度ρ和COC面积Si变化大体趋势为二次曲线模型，证明提出算法的景深标定具有合理性。

图7 数据统计拟合图

3 结束语

针对光学显微镜存在小景深且景深范围不易测定的问题出发，提出了一种基于能量的活动轮廓与LBP分割跟踪COC边界的光学显微镜景深标定方法，根据跟踪得到的统计真圆度ρ和COC的面积Si数据进行DOF标定，最后，在实验平台下根据本文算法可测得DOF为72 μm。理论推导表明，所提出的算法适用于不同倍率下景深范围测定，实验结果分析证明，根据真圆度ρ与COC面积判定景深范围具有科学性，而且标定过程中只需要步进电机等间距定向移动拍摄，即可通过提出的算法有效的自动测量景深范围，对后续图像处理有重要意义。

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Depth-of-Field Automatic Calibration of Optical Microscope Based on LBP

CUI Li，LI Chang-yang
（Faculty of Information Science and Engineering，Ningbo University，Ningbo Zhejiang 315211，China）

As small DOF of optical microscope，the unsharpness is imperceptible under normal viewing conditions.In response to this issue，an optical microscope automatic calibration method is proposed to measure DOF.The proposed method is based on the convex active contour model and LBP algorithm which is easy to work.Additionally，the proposed method provides lower cost than other methods.Firstly，spot calibrate board is fixed on the working stage controlled by the stepper motor，and the sequence images is captured by moving along z-axis from the front of DOF to the back of DOF equidistantly.Secondly，search the circle contour by active contour model in the sequence images.Then，LBP algorithm is utilized on the calibrate sequence images so as to get the circle contours more accurately.Finally，according to the roundness of the contours and circle areas in the statistics list，DOF of optical microscope is effective calibrated.Experimental results demonstrate that the proposed method can be used to measure the DOF on optical microscope，which is of great significance for the follow-up image processing.

Depth-of-Field；active contour model；LBP；roundness；Circle of Confusion

TP391.4

A

1003－3114（2015）06－79－5

10.3969／j.issn.1003－3114.2015.06.21

崔 力，李长阳.基于弥散圆的光学显微镜景深自动标定方法［J］.无线电通信技术，2015，41（6）：79－83.

2015－07－15

崔 力（1989―），男，硕士研究生，主要研究方向：显微图像处理测量技术。李长阳（1990―），女，硕士研究生。主要研究方向：显微图像处理测量技术。