复合酶漱口液消减牙菌斑的效果分析*

陈谷 雷海金 王宏 陈聪聪 向佳佳 张少波

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

复合酶漱口液消减牙菌斑的效果分析*

陈谷 雷海金 王宏 陈聪聪 向佳佳 张少波

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

龋齿的发生与牙齿表面附着的牙菌斑和细菌的作用密切相关，文中旨在通过复合酶液降解葡聚糖和淀粉类物质来消除牙菌斑的存在基础，考察去除牙菌斑的效果.实验通过测定20名志愿者使用含不同浓度的复合酶漱口液、不含酶漱口液(无酶对照组)及市售精油类漱口液前后的Tureskey改良的Q-H菌斑指数的改变情况，考察β-葡聚糖酶和α-淀粉酶复合酶漱口液降解牙菌斑的效果.统计学结果显示含酶量大于0.5mg/L时，牙菌斑降低率显著优于无酶对照组;且含酶量大于5.0mg/L时，牙菌斑降低率优于某市售精油类漱口液.结果表明含酶漱口液对抑制牙菌斑的作用效果明显.文中研究为龋齿的日常防治提供了理论依据.

牙菌斑;Q-H菌斑指数;复合酶漱口液;β-葡聚糖酶;α-淀粉酶

龋齿是口腔的常见病和多发病，尽管科技发展、各种口腔护理用品广泛推广和应用，龋齿仍然是造成不同年龄阶段人群咀嚼困难的主要原因.人体口腔中有各种各样的细菌菌群，是一个复杂的细菌“社区”［1-6］.其中的致龋菌群与非致龋菌群相比有独特的特征，如:①对牙齿表面有较强的定植粘附能力;②具有较强的产酸性和耐酸性;③能分泌葡糖基转移酶合成胞外多糖，易形成生物膜－牙菌斑［6-7］.目前，口腔中的主要致龋菌群有3大类，即链球菌属、乳杆菌属、放线菌属.研究表明，变形链球菌为革兰氏染色阳性的一种球菌，是人体口腔天然菌群中所占比例最大的链球菌属中的一种.变形链球菌生长在含蔗糖的培养基中，可产生大量的高分子质量物质——非水溶性葡聚糖，并同时观察到变形链球菌的富集现象.葡聚糖作为一种粘性的胶体物质，提供细菌聚集的场所，而变形链球菌具有一种表面受体，可将葡聚糖分子束缚在一起，在牙齿上形成菌斑［8］.牙菌斑是龋齿和牙周病重要的致病因素之一，抑制牙菌斑的发生和发展对于预防控制龋齿和牙周病至关重要.刷牙是维护口腔健康的主要方式，但是存在一定的局限性.常规刷牙只能清除牙面上40%～50%的菌斑，即使经过专业的指导，也只能清除70%左右的菌斑，而对于牙齿邻面和口腔其他部位的菌斑仅能清除少量或无法清除［9］，因此漱口液成为一种有效的辅助方法.目前常用的漱口液为冼必泰类和精油类漱口液，它们通过抑制微生物的生长和酶活来达到降低口腔中微生物水平的效果［10］，而较少关注对已形成的生物膜群落——牙菌斑的清除效果.目前，利用生物方法(酶法)去除牙菌斑的研究应用较少.Inoue等［11］对人体口腔的研究显示α-1，3-葡聚糖酶漱口液对抑制牙菌斑有显著的效果.Poulsen等［12］使用含葡聚糖酶的漱口液对大鼠进行研究，结果表明它对抑制牙菌斑和龋齿的发生都有显著效果.α-葡聚糖酶去除牙菌斑的效果虽然很好，但是它较难获得且价格高.

广谱的杀灭或抑制口腔细菌的漱口液没有选择性，不利于维持口腔正常菌群平衡，甚至可能导致其他口腔疾病，如口腔粘膜炎、口腔溃疡、真菌感染的白色念珠菌病等.而清除导致龋齿的直接原因牙菌斑有利于维持口腔正常菌群平衡.目前酶制剂对口腔牙菌斑清除效果的人体实验相当匮乏，故文中开展小范围的人群实验，为后续产品开发奠定基础.

文中采用两种比较常见的酶——β-葡聚糖酶和α-淀粉酶进行组合，选用食品级酶制剂，开展人体口腔试验，对比β-葡聚糖酶和α-淀粉酶复合酶漱口液与不添加酶的漱口液、市售精油类漱口液降解牙菌斑的效果，以期获得能更高效地维持口腔健康的方法.

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

实验所用的酶全部使用食品级酶(见表1).本实验中所使用的牙菌斑显示剂由北京世恒尔力科贸有限公司提供，制造商是加拿大的GERMIPHENE公司，其主要成分为赤藓红.牙菌斑显示液为食品级试剂，无毒性、无耐药性.

表1 实验所用食品级酶Table 1 Food-grade enzymes used in this paper

1.2 漱口液的配制与保藏

实验组设置6种不同浓度的自制含酶漱口液、一种无酶漱口液(为阴性对照)以及一种市售的精油类漱口液(作为阳性对照)，共 8种.含酶漱口液(A1－A6)、无酶漱口液(A0)均由实验室配制.自制含酶漱口液采用β-葡聚糖酶和α-淀粉酶等比例混合溶于磷酸盐缓冲液(简称PBS)配制而成，漱口液含酶量(溶质溶剂配比)见表2.无酶漱口液成分除未添加酶液外，其他成分与含酶漱口液完全一致.所选用的阳性对照为某品牌市售精油类漱口液(B)，其有效成分为麝香草酚、桉叶油素、水杨酸甲酯、薄荷醇和乙醇，能够快速渗透牙菌斑生物膜，可以原位杀死较广泛的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌［10］.

表2 含酶漱口液配比Table 2 Proportion of enzyme added in mouthwash

PBS缓冲溶液配方:磷酸二氢钾0.27 g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，再加入浓盐酸调pH值至7.4，再使用灭菌的0.22μm过滤器过滤，最后定容到1L.高温高压灭菌后置于4℃冰箱保存待用.

酶原液配方:取等量β-葡聚糖酶和α-淀粉酶各0.5g，混合溶于1L PBS缓冲液中，质量浓度为1g/L.经过高速离心后，使用灭菌的0.22μm过滤器过滤，过滤后置于4℃冰箱保存待用.

含酶漱口液配方:取适量酶原液，用配制的PBS缓冲溶液按配比稀释，于4℃冰箱保存待用.实验前用恒温水浴锅加热到35℃.

1.3 实验对象的纳入和排除标准

实验对象为按纳入标准随机选取的20名在校本科生青年志愿者.所有纳入的实验对象了解本实验的内容和实验要求，均签署知情同意书，志愿者有权在研究过程中在任何时间以任何理由退出研究.纳入标准:全身健康状况良好;全口不得少于20颗功能牙;试验前3个月内未服用抗生素;受试牙及邻牙无倾斜、发育异常、牙周袋及牙龈退缩，无冠和固定桥修复及佩带正畸矫治器，牙面及根面无充填物及龋损，若受检牙缺失则以对侧同名牙或同侧邻牙替代;口腔黏膜、牙龈无病理性改变;无吸烟及酗酒习惯;未同时参加其他类似试验研究.排除标准:正在服用其他可能影响试验结果的药物;在参加实验前3个月内使用过抗生素［13］.

1.4 实验方法

［13-14］，依以下方法实验.实验当天受试者根据要求在早上进行口腔清洁后正常饮食，直至实验前不再进行任何口腔清洁措施，晚上十点正式开始实验.受试者先用灭菌棉签蘸取适量牙菌斑显示液轻轻涂在受检牙面上进行牙菌斑染色，停留30s，然后用清水漱口3次，根据Tureskey改良的Q-H菌斑指数计分标准对Ramfjord指数牙牙面菌斑面积进行菌斑指数值计分(见表3);每个受试者的6颗Ramfjord指数牙16、21、24、36、41、44的唇颊面的初菌斑指数为I1，然后使用给定的漱口液进行含漱2min，每次20mL.含漱结束后再用清水漱口3次，采用相同方法检查并记录后菌斑指数I2.牙菌斑的改变量为I1－I2，牙菌斑的降低率为(I1－I2)/I1.

每位受试者的菌斑指数值计分为6颗牙的计分之和除以6.FDI(国际牙科联盟)牙位表示法见表4.每单项实验结束后恢复日常清洁措施，消除前一种漱口液存在的残留作用与影响.3d后使用另一种漱口液进行实验，方法同前.

表3 菌斑指数计分标准Table 3 Judging standards of plague index

表4 FDI牙位表示法中的Ram fjord指数牙1)Table 4 Ramfjord tooth in FDI dental notation

1.5 数据统计学处理

试验结果采用SPSS18.0软件包进行两样本均数的t检验.显著性检测采用LSD法，P＜0.05为显著差异，P＜0.01为极显著差异.

2 结果与分析

2.1 不同成分漱口液漱口前后菌斑指数的变化

对比不同浓度含酶漱口液、以无酶漱口液为阴性对照、一种市售的精油类漱口液为阳性对照，20名志愿者使用漱口液漱口后口腔内牙菌斑集聚的降低率呈现一定的规律.使用市售精油类漱口液后，牙菌斑集聚的平均降低率约为51.04%;而使用仅含PBS的漱口液后，牙菌斑集聚降低率仅为18.02%;使用含不同酶浓度的复合酶漱口液后，牙菌斑集聚降低率约为32%～80%，随着酶浓度增高，牙菌斑降低率增加，呈现剂量依赖关系(见图1).与无酶漱口液组(A0)相比，使用含酶漱口液后牙菌斑的降低率均有显著的增加，P＜0.001;表明与无酶漱口液相比，含酶漱口液具有显著的清除牙菌斑的作用(见图1、表5).与市售的精油类漱口液组(B组)相比，含酶漱口液也呈现一定的差异.低剂量的含酶组A1、A2(即含酶量为0.5mg/L、1.0mg/L)牙菌斑的降低率低于精油类漱口液组(B组);含酶组A3(即含酶量为2.0 mg/L)牙菌斑降低率与B组相当，而高剂量含酶组A4、A5、A6(即含酶量为5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/ L)显示出较显著的优势，牙菌斑的降低率显著高于B组(P＜0.001，见表6、图1).这表明使用含酶漱口液对牙菌斑的去除具有明显效果，漱口液含酶量越大，作用效果越显著.市售的精油类漱口液也有一定的清除牙菌斑的作用，但高浓度的复合酶漱口液显示出较市售精油类漱口液更好的效果.

图1 各组间牙菌斑降低率的比较Fig.1 Comparison of the reduction of dental plague index in different groups

表5 不同浓度含酶组与无酶组的比较Table 5 Comparison between groups with enzyme and without enzyme

表6 不同浓度含酶组与精油类漱口液组的比较Table 6 Comparison between groups with enzyme and commercialmouthwash

分析认为，实验中所用β-葡聚糖酶专一作用于β-葡聚糖的1，3及1，4糖苷键，产生3到5个葡萄糖单位的寡聚糖及葡萄糖.实验所用α-淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等α-1，4-葡聚糖，无差别地随机切断糖链内部的α-1，4-糖苷键，可以清除食物残渣中的淀粉类物质，抑制牙菌斑的形成［7，11］.另一方面，有研究表明α-淀粉酶能够特异性地与链球菌属结合［7］，因此漱口液中含有α-淀粉酶可能会影响牙菌斑中的主要群体链球菌属的定植.β-葡聚糖酶和α-淀粉酶复合酶漱口液显示了良好的消减牙菌斑的效果，进一步的实验将与α-1，3-葡聚糖酶、α-1，6-葡聚糖酶［15-16］进行组合，预期会有更好的清除牙菌斑的作用效果.

试验中所用市售精油类漱口液是一种以精油为主要有效成分的漱口液，能够有效快速地渗透牙菌斑生物膜，并可以原位杀死致病菌.但是在清除牙菌斑方面，效果不如高浓度的含酶漱口液.此外精油类漱口液的主要成分是乙醇、三氯苯氧氯酚和桉精油，其辛辣刺激的口感可能会引起部分消费者的不适.近年来植物化学物在维护口腔健康的作用日益吸引人们的关注［17-18］.

2.2 不同志愿者在实验组间牙菌斑降低率的统计分析

对20名志愿者的不同含酶实验组间牙菌斑降低率数据进行无重复双因素方差分析和回归分析(见表7)，结果显示相关系数Multiple R(r)＞0，表明菌斑指数降低率与酶组之间为正相关，存在一定程度的线性相关;而且20名志愿者的相关系数Multiple R值均在0.9以上，R Square(可决系数R2)值在0.8以上，表明数据是可靠的，从而有力地证明了菌斑指数降低率与含酶各组之间存在高度线性相关，如表7所示.

表7 不同志愿者在实验组间菌斑指数降低率的无重复双因素方差分析和回归分析Table 7 Two factors variance and regression analysis of the decrease of dental plague index in volunteers from different experimental groups

3 结语

漱口是口腔保健的重要措施之一，漱口液清除牙菌斑的效果直接与口腔保健效果相关.本实验遵守随机单盲自身对照原则，进行人体口腔实验，考察复合含酶漱口液清除牙菌斑的效果.结果显示β-葡聚糖酶和α-淀粉酶复合酶漱口液含酶组在含酶量大于0.5mg/L时，各组在清除牙菌斑方面均显著优于无酶组(P＜0.001).且当含酶量大于5.0mg/L时，牙菌斑降低率优于某市售精油类漱口液，且口感无刺激.故开发高效去除牙菌斑、口感温和的复合酶漱口液有广阔的应用前景.文中所采用的方法和结论为后续正在开展的植物化学物在口腔健康中的研究奠定了良好基础.

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Analysis of Elim ination Effect of Enzyme-Combined M outhwash on Dental Plague

Chen Gu Lei Hai-jin Wang Hong Chen Cong-cong Xiang Jia-jia Zhang Shao-bo
(School of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China)

Dental caries is closely related to dental plaque，a biofilm in which bacteria attach to the teeth surface.This paper dealswith the feasibility of eliminating dental plague by using a kind ofmouthwash in which combined enzymes are used to degrade glucan and starch.In the investigation，the Tureskeymodified Q-H indexes of 20 volunteersweremeasured to compare the elimination effectof the enzyme-combinedmouthwash，themouthwash without enzymes and the commercially availablemouthwash with essential oil.Statistical results indicate that，when the enzyme content is higher than 0.5mg/L，the mouthwash containingβ-glucanase andα-amylase ismore effective than the one withoutenzymes;and that，when the enzyme content is higher than 5.0mg/L，the enzyme-combined mouthwash presents a dental plague elimination rate higher than that of the commercially availablemouthwash.It is thus concluded that themouthwash with combined enzymes is effective in eliminating dental plague.This research lays a theoretical foundation for developing products for the daily prevention of dental caries.

dental plague;Q-H dental plague index;enzyme-combined mouthwash;β-glucanase;α-amylase

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31270085)

R78

10.3969/j.issn.1000-565X.2015.06.022

1000-565X(2015)06-0142-05

2014-07-03

国家自然科学基金资助项目(31270085)

陈谷(1973-)，女，博士，副教授，主要从事分子生物学与微生物生理生化研究.E-mail:chengu@scut.edu.cn