铜绿假单胞菌对萘菲的降解研究

雒晓芳，汪如婷，田丹妮，莫芳芳，马麟龙

(1.西北民族大学实验中心，甘肃兰州730100；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州730100)

铜绿假单胞菌对萘菲的降解研究

雒晓芳1，汪如婷2，田丹妮2，莫芳芳2，马麟龙2

(1.西北民族大学实验中心，甘肃兰州730100；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州730100)

文章以萘、菲为惟一碳源，研究了铜绿假单胞菌对萘、菲的降解特性试验.结果表明，铜绿假单胞菌能以萘、菲为惟一碳源，对萘、菲具有较好的降解能力.21天菲与萘的最高降解率分别可达95.1%和92.3%.此菌株对菲、萘的脱氢酶活性有一定的影响，0～10天其脱氢酶活性迅速增强，10天达到最高值，随后逐渐下降.从微生物数量可知，不同浓度的萘、菲对微生物的生长也有较大的影响.浓度过低时，菌体生长缓慢；浓度过高，铜绿假单胞菌本身产生的副作用会抑制微生物的生长.

铜绿假单胞菌;萘;菲;降解能力

多环芳香烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,简称PAHs)是最早被认识的致癌化合物，分子结构中一般具有两个或两个以上苯环结构的烃类化合物.它一般是无色，或浅黄绿色的固体结晶.多环性芳香化合物在一些石油开采区、煤厂开采区、垃圾的焚烧处理厂，一些碳氢化合物的不完全燃烧所产生.多环芳香烃类物质在自然界中能够维持相对的稳定状态，这主要得益于它能够自我降解.它降解的方式包括生物降解、氧化、光作用裂解等方式，其中起到主要作用的是生物的降解[1].自然界有着丰富的降解的微生物资源，这些资源能够维持环境中的多环芳香烃类物质的动态平衡，在自然环境中始终处于较低浓度的水平上.但随着自然环境的开发、经济迅速的发展，人类生产活动无休止的开发与索取原料，破坏了环境的生态平衡，使得自然界中多环芳香烃类物质含量的相对平衡被破坏.多环芳香烃在一些石油，天然气及防腐剂生产区的土壤中广泛存在.土壤是多环芳香烃类在环境中累积和迁移的重要载体之一[2].由于多环芳香烃具有低水溶性和高辛醇-水分配系数，因而易被吸附到土壤颗粒上，并在粮食与蔬菜等作物体内富集，并通过食物链威胁着人类的健康，因而对多环芳香烃的认识、处理、掌握及其降解的机理等是至关重要的[3-4].萘与菲都是平面型分子，分子中的三个苯环都在同一个平面上，菲的一元取代物异构体比萘的多，菲一共有五种一元异构体.菲的芳香性比萘差，因而它比萘更容易反应.菲在结构上有一个湾区和一个K区，这两个结构可能是与PAHs的致癌有关.同时菲的这种结构对研究PAHs降解氧化酶的立体选择性至关重要，因此菲成为了PAHs研究的模式化合物.又因菲在环境和生物体内检出率非常高，所以菲成为了PAHs的代表物之一.目前对于降解多环芳香烃类化合物的途径有许多种，但是相对来说,比较有效、环保、不产生二次污染的方法当属于微生物降解了[5].

本实验通过从甘肃陇东油田第27号油井附近土壤样品中分离纯化所得的铜绿假单胞杆菌,研究其对萘菲的降解特性,以便为多环芳香烃类污染的生物修复提供相应的理论依据和治理措施，对降低或消除多环芳香烃类化合物的污染，成功实现多环芳香烃类的生物修复具有重要的意义[6].

1 材料与方法

1.1 菌种来源

本实验所用的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，简称PA，是由西北民族大学实验中心微生物实验室分离纯化所得.

1.2 主要试剂

萘、菲、正己烷、活性炭、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、无机盐培养基等.

1.3 实验方法

1.3.1 铜绿假单胞菌(PA)对萘、菲的降解

将菌种在营养肉汤液体培养基中培养48 h得到种子液，之后4 000 r/min离心3 min，弃上清.将菌体用灭菌的无机盐液体培养基洗涤3次，最后用无机盐培养基制成菌悬液.以上操作保持无菌条件.于每个50 mL三角瓶中加入15 g活性炭，按不同的浓度(3%、5%、7%、10%)加入萘或菲的正己烷溶液，在超净台中放置，待正己烷挥发完全后，加入15 mL菌液，置30 ℃振荡培养箱中培养.设置5个重复组，在0 d、3 d、7 d、10 d、14 d、21 d时，测定其降解率.

1.3.2 微生物数量测定方法

当培养物培养到0 d、3 d、7 d、10 d、14 d、21 d时，分别称取样品1 g，加入到含9 mL无菌水的无菌试管中，混匀后得到稀释度为10-1的悬浊液，吸取1 mL加入第二个装有9 mL无菌水的试管中，依次稀释，保留稀释度为10-5、10-6、10-7的样品.用移液枪分别吸取稀释度为10-5、10-6和10-7的样品0.1 mL加入预先倒好培养基的平皿里，用无菌涂布棒涂布均匀.每个稀释度重复两次，涂完后将平皿倒置放入28 ℃恒温培养箱内静置培养.48 h后将培养好的平皿置于菌落计数仪上统计菌落数.然后通过公式：微生物数量(cfu/g)=(平均菌落数*稀释倍数)/每个平皿中所加菌的量.

1.3.3 萘、菲标准曲线的绘制

用正己烷分别准确配置浓度梯度为0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L、0.04 g/L、0.05 g/L的萘、菲标准溶液，在紫外分光光度计上分别于268 nm和293 nm波长下测定吸光值，得出萘和菲的标准曲线.

1.3.4 脱氢酶活性的测定

取8支试管，进行标记，依次加入2 mL Tris-HCl缓冲液和2 mL 蒸馏水.然后按照标记加入2 mL 浓度分别为20 ug/mL、40 ug/mL、60 ug/mL、80 ug/mL、100 ug/mL、120 ug/mL、140 ug/mL的TTC系列溶液.对照管不加TTC溶液；再各加入1 g低亚硫酸钠，振荡摇匀，待溶液充分显色后，各管分别加入5 mL甲苯，振荡萃取2 min，静置.待溶液分层后，取上层溶液在紫外可见分光光度计上486 nm处用甲苯作空白测定吸光度并绘制标准曲线.

2 结果与分析

2.1 脱氢酶标准曲线

图1为脱氢酶的标准曲线，脱氢酶的标准曲线的线性方程为y=0.013x-0.0102，相关系数R2=0.9939，x表示TTC浓度，y表示在不同浓度的TTC对应的吸光度值.

2.2 菲与萘的标准曲线

图2为菲的标准曲线，线性方程为y=71.52x+0.194，相关系数R2=0.985，x表示TTC浓度，y表示在不同浓度的TTC对应的吸光度值.图3为萘的标准曲线，线性方程为y=48.25x-0.017，相关系数R2=0.999，x表示TTC浓度，y表示在不同浓度的TTC对应的吸光度值.

2.3 菲、萘的降解率

以正己烷为空白对照，用紫外分光光度法分别在268 nm和293 nm处测得萘和菲的标准曲线，根据标准曲线计算萘、菲的降解率.

图1 脱氢酶标准曲线

图2 菲的标准曲线 图3 萘的标准曲线

图4 不同培养天数菲的降解率 图5 不同培养天数萘的降解率

图4、图5反映的是3%～10%的萘、菲浓度随时间的变化，其降油率的变化.从0～21天间，0～5天萘、菲被快速降解，5天后降解速率减慢，尤其是14～21天内，萘和菲的降解量很少.估计可能是随着反应的进行，微生物不断代谢，细胞有害的产物积累过多等抑制了对萘与菲的进一步降解[7]，加上营养物质消耗，酶促反应速率减小，使降解速率减缓.

另一方面,萘、菲的浓度对微生物的降解作用有着显著的影响.由于萘或菲是降解体系中惟一碳源，当浓度过低时会影响微生物的生长，也不利于降解的进行；而当浓度过高时，微生物的生长会受到抑制[8].菲与萘的降解率都随着浓度的增加而降低，铜绿假单胞菌对3%的菲与萘降解效果最好，但是两者的降解率也有所不同，菲的芳香性因为比萘的差，所以它比萘更容易反应.经过21 d，菲与萘的降解率达到95.1%，92.3%.

2.4 脱氢酶活性的测定

在0 d、3 d、7 d、10 d、14 d、21 d时取样测其脱氢酶活性.将测得的吸光度值代入式：y=0.013x-0.0102，求得脱氢酶活的值.

图6 菲脱氢酶活性 图7 萘脱氢酶活性

由图6、图7可知，铜绿假单胞菌株对菲与萘的脱氢酶活性有一定的影响，0～10天其脱氢酶活性迅速增强，10天时达到最高值，随后逐渐下降. 从图6、图7可知，3%的菲脱氢酶活性最佳.5%的萘脱氢酶活性最佳；其余浓度均次之.可见，在相同的条件下菲在较低的正己烷溶液中其脱氢酶活性就比萘的要高.通过物理分析也可以证明，菲与萘都是平面型的分子，三个苯环分子都在一个平面上，菲的一元取代物有五种异构体，而萘的只有两种.还有菲的芳香性比萘的差，因此菲比萘更容易发生反应，所以菲在环境中的检出率很高[9]，是典型的PAHs代表物之一.

2.5 微生物数量的测定

通过微生物数量(cfu/g)=(平均菌落数*稀释倍数)/每个平皿中所加菌的量公式，计算微生物数量，结果如图8、9所示.

图8 菲微生物数量 图9 萘微生物数量

由图8、图9可知，反应体系中菲与萘两个反应体系中的微生物数量的生长规律都是先增大后减小的趋势.0～7天内，两个反应体系中微生物数量相对来说增长缓慢，待菌株适应新的生长环境后，开始加速生长，培养到第10天时，微生物数量达到最大，而后由于微生物的生长达到一定的值，这样利用的碳源和养分不断消耗，加上代谢产物的积累对微生物的抑制作用，铜绿假单胞菌的生长开始进入衰退期.萘、菲的浓度对微生物的生长有较大的影响，浓度过低时，由于碳源不足，菌体生长缓慢[10].而浓度过高，一切生命体其本身所需的物质都是有一定的量，但达到它的极限后反而起到抑制作用.因此，碳源过高对于铜绿假单胞菌本身产生的副作用会抑制微生物的生长[11].因此铜绿假单胞菌的菌体生长量随着萘、菲浓度的升高反而降低.

3 结论

通过研究铜绿假单胞杆菌对萘菲的降解特性实验可知,铜绿假单胞菌均能以萘与菲为惟一碳源生长，对萘、菲有较好的降解能力，21 d对菲与萘的降解率最高可达95.1%和92.3%.其次，铜绿假单胞菌株对菲与萘的脱氢酶活性有一定的影响， 0～10天其脱氢酶活性迅速增强，10天达到最高值，随后逐渐下降.萘、菲的浓度对微生物的生长也有较大的影响，浓度过低时，菌体生长缓慢；浓度过高时，铜绿假单胞菌本身产生的副作用会抑制微生物的生长.

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Research on the Features for Naphthalene and Phenanthrene Degradation by Pseudomonas aeruginosa

LUO Xiao-fang1, WANG Ru-ting2,TIAN Dan-ning2,MO Fang-fang2,MA Ling-long2

(1.Center of Experiment, Northwest University for Nationality, Lanzhou 730030, China；2. of Life Science and Engineering College, Northwest University for Nationality, Lanzhou 730030, China)

The researches on the pseudomonas aeruginosa degradation of the naphthalene and phenanthrene were performed in different concentrations under the sole carbon resource of the naphthalene and phenanthrene. The results showed that the pseudomonas aeruginosa can grow under this condition and degraded fully naphthalene and the phenanthrene. The maximum rates of degradation for naphthalene and the phenanthrene reached 95.1% and 92.3% at 21 days, respectively. Additionally，pseudomonas aeruginosa could influence the dehydrogenase activity to a certain extent. The dehydrogenase activity increased rapidly from 0 to 10 day, and reached the peak values at day 10. Then it decreased gradually. According to the bacteria numbers, the different concentrations of naphthalene and phenanthrene had obvious impacts on the growth of microorganism. Enough high concentration of pseudomonas aeruginosahad would inhibit bacteria growth owing to its side effects.

Pseudomonas aeruginosa；Naphthalene；Phenanthrene；Abilities of degradation

2015-05-20

甘肃省自然科学基金项目(1308RJZA187)；2014年甘肃省教育厅项目(2014B-010);西北民族大学2015年本科生科研创新项目(URIP15166).

雒晓芳(1980—)，女，宁夏泾源人，副教授，硕士,主要从事环境微生物学方面的研究.

TQ423

A

1009-2102(2015)02-0025-05