细胞毒T淋巴细胞相关抗原4基因多态性与宫颈癌的相关性研究

王甲甲，王智斌，黄文芳

(四川省医学科学研究院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072)

细胞毒T淋巴细胞相关抗原4基因多态性与宫颈癌的相关性研究

王甲甲，王智斌，黄文芳

(四川省医学科学研究院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072)

目的 探讨细胞毒T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)-318 T/C、CT60 G/A、+49 G/A基因多态性与宫颈癌之间的相关性。方法 选取2012年12月至2014年7月292例宫颈癌患者(患者组)，及同期355例健康体检者(对照组)，采集研究对象外周静脉血5 ml，抽提全血基因组DNA，PCR扩增后直接测序法检测CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A基因多态性的分布。结果 Logistic回归分析显示，-318CC和CT60 AA基因型均与宫颈癌发病相关(P< 0.05)。与对照组比较，携带CTLA-4-318T、CT60 g等位基因的宫颈癌患者明显增加(均P< 0.05)；携带CTLA-4 +49 gG基因型、+49A等位基因的宫颈癌患者，差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 CTLA-4-318、CT60基因多态性与宫颈癌发病有关。

CTLA-4；基因多态性；宫颈癌

宫颈癌是女性的第二大常见的恶性肿瘤[1]。人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是公认的宫颈癌的高危因素，近90%的宫颈癌患者均可检测到HPV感染，然而，并非所有感染HPV的病例均会发展为宫颈癌，这意味着环境因素、遗传学或免疫学等因素可能在宫颈癌的发生过程中也起着关键的作用[2，3]。有学者认为，宫颈癌患者体内存在抑制性免疫微环境，特别是在年轻患者和病情严重患者更为明显，其中T细胞表面的细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)分子发挥重要作用[4]。人类CTLA-4基因定位于2号染色体长臂33带(2q33)，主要表达在活化的T细胞上，它可与抗原提呈细胞表面的B7分子结合并抑制T细胞的增殖与活化，其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)与乳腺癌、黑色素瘤、肾癌等人类肿瘤的发生均有密切的关系[5～7]。为了验证CTLA-4基因遗传多态性是否与宫颈癌的发生相关，我们选择了CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A位点进行对照研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2012年12月至2014年7月在四川省人民医院就诊且病理学确诊为鳞癌的宫颈癌患者292例作为患者组，均为新发病例，年龄25～72岁，无任何治疗经历。同期355例健康体检人员作为对照组，无癌症病史，无任何宫颈上皮病变，宫颈细胞学检查阴性，宫颈分泌物HPV检查阴性。通过填写调查问卷的方式获取各研究对象的临床病理学信息，本研究获得医院医学伦理学委员会批准，临床资料及标本采集均获患者知情同意。除HPV 感染率外，两组其他基线资料比较，差异均无统计学意义(P> 0.05)，见表1。

表1 两组基线资料比较 [n(%)]

1.2 研究方法

1.2.1 标本的获取与保存 采集各研究对象空腹静脉血5 ml于乙二胺四乙酸(EDTA-K2)抗凝管中，用全血基因组小量抽提试剂盒提取全血DNA，操作步骤按照试剂盒说明书进行，置于-80 ℃冰箱冻存备用。

1.2.2 引物设计与合成 根据Genbank中CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A的序列号(分别为rs5742909，rs3087243，rs231775)，用Primer premier 5.0软件设计引物，引物的具体信息见表2，由上海生工公司合成。

1.2.3 HPV基因型的检测 取各研究对象宫颈脱落细胞用导流杂交法(凯普公司人乳头瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒)检测感染的HPV基因型。

1.2.4 CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A基因多态性的检测 PCR体系组成如下(20 μl)：基因组DNA 2 μl(约0.2 μg)，10×PCR缓冲液2 μl，25 mM MgCl2溶液2 μl，10 mM dNTPs 2 μl，1 U/ μl Taq DNA聚合酶2 μl和5 μmol/L上、下游引物各1 μl，灭菌ddH2O 8 μl。PCR反应程序如下：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 再延伸5 min。扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定PCR产物为目的片段，且无非特异性扩增后，送上海生工公司进行DNA测序。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件和SHEsis在线平台进行数据分析。计数资料比较采用卡方检验；SHEsis在线平台计算各位点间的连锁不平衡并进行组间单倍型频率的比较；相关因素的探讨采用Logistic回归分析。检验标准α=0.05。

2 结果

2.1 遗传平衡检验 CTLA-4-318 T/C、CT60 G/A、+49 G/A基因型经遗传平衡检验，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P> 0.05)，具有群体代表性。

2.2 Logistic多元回归分析 基因多态性与宫颈癌的关系 Logistic回归分析显示，-318CC和CT60 AA基因型均与宫颈癌发病有关(P< 0.05)。与对照组比较，携带CTLA-4-318 T、CT60 G等位基因的宫颈癌患者明显增加(χ2分别为13.482和14.138，均P<0.05)；携带CTLA-4 +49 gG基因型、+49A等位基因的宫颈癌患者，差异无统计学意义(P> 0.05)，见表3。

表2 CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A引物的基本信息

2.3 CTLA-4基因多态性单倍型与宫颈癌发生的关系 不同CTLA-4-318 T/C和CT60 G/A单倍型携带者与宫颈癌发病风险关系的结果见表4，CTLA-4-318 C/CT60 A单倍型者发生宫颈癌的风险低于CTLA-4-318 T/CT60 G单倍型携带者(P<-0.05)，而CTLA-4-318 C/CT60 G，-318 T/CT60 A单倍型携带者发生宫颈癌的风险与CTLA-4-318 T/CT60 G单倍型者差异无统计学意义(P> 0.05)。

表3 CTLA-4 SNPs 在两组的分布情况

表4 CTLA-4基因多态性单倍型与宫颈癌发病风险的关系

3 讨论

CTLA-4是细胞表面共刺激分子，与CD28分子属于同一家族，均可与B7细胞表面分子相结合，在T细胞介导的自身免疫性疾病的遗传易感性上起重要作用[8]。CD28/B7复合物与CT LA-4/B7复合物在T细胞反应机制上的作用截然相反，前者能够促进T细胞发生免疫应答，而后者对免疫反应起下调和抑制作用[9]。Janeway等[10]提出T细胞激活的双信号理论，第一信号由T细胞受体TCR与MHC抗原肽的结合提供，第二信号由APC表面的共刺激分子与T细胞表面相应受体结合而提供。CTLA-4作为CD28的拮抗剂，竞争性与APC表面的相应配体B7结合，从而下调T细胞的反应，是传递第二信号的重要分子。大量文献报道，CTLA-4基因多态性与自身免疫性疾病的发生密切相关，近年来，CTLA-4基因多态性与肿瘤发生之间的关系得到了越来越多的关注，本研究即旨在探讨CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A基因多态性与宫颈癌发病的相关性。

挑选292例宫颈癌患者和355例年龄匹配的健康对照者参与本研究。由于HPV感染与宫颈癌的发生关系密切，所有参与对象均需进行常规的HPV DNA检测，结果发现，87.0%的宫颈癌患者HPV检测均为阳性，这与其他研究报道结果基本一致[11]。采集各参与者的外周血，分别对292例宫颈癌患者和355例健康对照者进行CTLA-4 SNPs(-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A)的检测，结果发现，-318CC和CT60 AA基因型均与降低宫颈癌发病风险有关，与对照组比较，携带CTLA-4-318 T、CT60 G等位基因的宫颈癌患者明显增加。相反，CTLA-4 +49 G/A基因多态性与宫颈癌发生无相关关系(P> 0.05)。有报道却认为，CTLA-4 +49基因多态性与宫颈癌发生有密切关系，这可能与种族差异、样本量大小等有关[12]。

单倍型是指一条染色体上紧密连锁的多个等位基因的线性排列。SNP单倍型就是不同SNPs位点上核苷酸碱基的线性排列，每一种线性排列称为一种SNP单倍型。理论上讲单倍型出现的频率应是各个基因频率的乘积，但事实却非如此，连锁的单倍型并不是随机组合的，而是某些基因更多或更少的连锁在一起，即所谓的“连锁不平衡”。在探讨基因与疾病的相关性时，单倍型分析可能提供更多的信息，有利于更精确和客观地分析疾病的遗传易感性。由于前述研究结果认为，CTLA-4 +49 G/A基因多态性与宫颈癌的发生无明显的相关性，该研究仅对CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A基因多态性位点是否存在连锁不平衡进行分析，结果发现，CTLA-4-318 C/CT60 A与降低宫颈癌的发病风险有关，提示这两个多态性位点可能存在连锁不平衡。

综上所述，本研究认为CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A基因多态性与宫颈癌的发病风险相关。然而我们的结果需要进一步扩大样本量和种族进行验证。对于CTLA-4基因多态性的研究将有助于预测宫颈癌的发病风险，提高宫颈癌的预防及早期诊断水平。

[1] Fujiwara H，Shimoda A，Ishikawa Y，et al.Effect of providing risk information on undergoing cervical cancer screening：a randomized controlled trial[J].Arch Public Health，2015，73(1)：7.

[2] Fontenot HB.Urine-Based HPV Testing as a Method to Screen for Cervical Cancer[J].Nurs Womens Health，2015，19(1)：59-65.

[3] Lata K，Bhatla N.HPV testing for cervical cancer screening：Time for a new paradigm[J].Natl Med J India，2014，27(4)：212-213.

[4] Lee YH，Song GG.A meta-analysis of the association between CTLA-4 +49 A/G，-318 C/T，and IL-1 polymorphisms and susceptibility to cervical cancer[J].Neoplasma，2014，61(4)：481-490.

[5] Li D，Zhang Q，Xu F，et al.Association of CTLA-4 gene polymorphisms with sporadic breast cancer risk and clinical features in Han women of northeast China[J].Mol Cell Biochem，2012，364(1-2)：283-290.

[6] Bouwhuis MG，Gast A，Fig A，et al.Polymorphisms in the CD28/CTLA4/ICOS genes：role in malignant melanoma susceptibility and prognosis[J].Cancer Immunol Immunother，2010，59(2)：303-312.

[7] Cozar JM，Romero JM，Aptsiauri N，et al.High incidence of CTLA-4 AA(CT60)polymorphism in renal cell cancer[J].Hum Immunol，2007，68(8)：698-704.

[8] 陈水连，邓斐，江峰，等.CTLA-4启动子区基因多态性与系统性红斑狼疮关系的meta分析[J].细胞与分子免疫学杂志，2012，28(12)：1320-1323.

[9] Leung J，Suh WK.The CD28-B7 Family in Anti-Tumor Immunity：Emerging Concepts in Cancer Immunotherapy[J].Immune Netw，2014，14(6)：265-276.

[10]Janeway CA，Bottomly K.Signals and signs for lymphocyte responses[J].Cell，1994，76(2)：275-285.

[11]Xiong YH，He L，Fei J.Genetic variations in cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 and susceptibility to cervical cancer[J].Int Immunopharmacol，2014，18(1)：71-76.

[12]Lee YH，Song GG.A meta-analysis of the association between CTLA-4 +49 A/G，-318 C/T，and IL-1 polymorphisms and susceptibility to cervical cancer[J].Neoplasma，2014，61(4)：481-490.

The correlation of cytotoxic T lymphocyte antigen 4 polymorphisms with occurrence of cervical cancer

WANG Jia-jia，WANG Zhi-bin，HUANG Wen-fang

(Clinical Laboratory，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China)

Objective To explore the correlation between cytotoxic T lymphocyte antigen 4(CTLA-4)genotypes-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A and occurrence of cervical cancer.Methods Two hundred and ninety-two patients with cervical cancer from December 2012 to July 2014 were selected as study group，and 355 cases of healthy controls were recruited as control group.Peripheral blood of each participant was collected and genomic DNA was extracted.The distribution of CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A genotypes were detected by direct sequencing.Results The CTLA-4-318 CC and CT60 AA genotypes were correlated with the decrease of cervical cancer risk(P< 0.05).Compared with control group，the frequencies of CTLA-4-318T allele and CT60 g allele carriers were significantly higher in the cancer patients(P< 0.05).No significant differences were found in the genotype and allele frequencies in +49 G/A between patients and healthy controls(P> 0.05).Conclusion The polymorphisms of CTLA-4-318 and CT60 are correlated with cervical cancer risk.

CTLA-4；Genetic polymorphisms；Cervical cancer

R446.62

A

1672-6170(2015)05-0077-04

2015-02-26；

2015-04-30)