尼罗替尼应用于1型神经纤维瘤病相关肿瘤的体外研究

姜 伟，黄文芳，Claudia Schnabel，Lan Kluwe，Victor-F.Mautner，Reinhard E.Friedrich，Andreas Kurtz

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072；2.汉堡大学医学中心 a.神经内科，b.口腔颌面外科，汉堡 20246；3.柏林夏瑞蒂医学院勃兰登堡再生医学中心，柏林 10117)

尼罗替尼应用于1型神经纤维瘤病相关肿瘤的体外研究

姜 伟1，黄文芳1，Claudia Schnabel2a，Lan Kluwe2a，Victor-F.Mautner2a，Reinhard E.Friedrich2b，Andreas Kurtz3

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072；2.汉堡大学医学中心 a.神经内科，b.口腔颌面外科，汉堡 20246；3.柏林夏瑞蒂医学院勃兰登堡再生医学中心，柏林 10117)

目的 通过体外试验研究尼罗替尼(Nilotinib)对丛状神经纤维瘤(PNF)培养的Schwann细胞和恶性周围神经鞘瘤(MPNST)细胞生长特性的影响。方法 利用手术切除的PNF组织培养Schwann细胞和MPNST细胞，然后用不同浓度的尼罗替尼进行处理，测定细胞增殖、活力、凋亡和胞外胶原酶活性，评价药物的效能。结果 尼罗替尼处理后，细胞增殖和活力均下降，下降的程度与药物浓度成正比，其半数抑制浓度(IC50)为2.3～10.8 μM。此外，尼罗替尼抑制Schwann细胞和MPNST细胞胶原酶表达活性，并诱导MPNST细胞凋亡。结论 尼罗替尼在体外可有效抑制PNF肿瘤细胞和MPNST细胞的增殖和活力，促进MPNST细胞凋亡，值得进一步开展体内试验和作用机制研究。

尼罗替尼；1型神经纤维瘤病；丛状神经纤维瘤；恶性周围神经鞘瘤；体外研究

丛状神经纤维瘤(plexiform neurofibroma，PNF)是起源于外周神经鞘的良性肿瘤，多发生于1型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1，NF1)患者。临床上，PNF可引起疼痛、容貌损害、压迫和组织器官功能障碍等，并可进行性发展为恶性周围神经鞘瘤(malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST)[1]。MPNST是NF1患者死亡的主要原因之一[2]。目前，临床上对PNF和MPNST缺乏有效的药物治疗方案[3]。本研究通过体外实验分析尼罗替尼对Schwann细胞和MPNST细胞增殖、活力、凋亡和胶原酶活性等影响，探讨尼罗替尼应用于NF1治疗的潜力。

1 材料与方法

1.1 标本来源 病理明确诊断的PNF组织来自于2014年1～12月在汉堡大学附属医院口腔颌面外科的10例手术患者，其中男6例，女4例，年龄12～51岁[(35±10)岁]。研究内容经学术伦理委员会审核(批准号：OB-061/05)，患者知悉组织标本的使用并签署知情同意书。肿瘤组织在手术切除后置于Hanks平衡盐溶液(Sigma公司)中，用于Schwann细胞培养。3株MPNST细胞(S462、S1507和S1844)由汉堡大学附属医院肿瘤遗传学实验室建立[4]。

1.2 方法

1.2.1 组织消化 手术切除的PNF组织放入无菌磷酸盐缓冲溶液中，切成2～3 mm大小后置于细胞基础培养液(包括DMEM 500 ml、10%胎牛血清、500 U/ml 的青霉素和链霉素、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠；Gibco公司)中，置于37 ℃、5%CO2培养箱过夜。然后用含有0.5 mg/ml胶原酶和中性蛋白酶(Roche公司)的基础培养液对组织进行消化，24 h后，利用100 μm不锈钢网筛分过滤，1500 rpm离心5 min，弃去上清后的沉淀物为原代细胞。

1.2.2 细胞培养 Schwann细胞的培养表面需预先使用0.01%多聚赖氨酸和4 μM层粘连蛋白(Gibco公司)包被，其选择性培养液包括基础培养液、0.5 mM 3-异丁基-L-甲基黄嘌呤、2 nM heregulin、2.5 mM胰岛素(Sigma公司)。MPNST细胞的培养采用基础培养液加0.1 mM 2-巯基乙醇(Gibco公司)。根据细胞的生长情况，每3～5 d换一次培养液。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco公司)对贴壁生长的细胞进行消化后，1500 rpm离心5 min，收集细胞进行传代培养，取3～5代细胞进行实验。

1.2.3 细胞鉴定 培养的Schwann细胞(肿瘤细胞)常混有成纤维细胞(非肿瘤细胞)生长。两种细胞通过特异性免疫荧光抗体染色进行鉴定，并计算Schwann细胞比例。对于Schwann细胞的染色，采用兔抗人S100抗体和FITC结合的抗兔抗体(绿色)；而成纤维细胞染色采用抗成纤维细胞抗体(CD90)和FITC结合的羊抗鼠IgG抗体(红色)进行染色；应用碘化丙啶(蓝色)染色细胞核(DAKO公司)。只有S100阳性细胞≥80%的Schwann细胞培养物才纳入实验研究。

1.2.4 药物处理 由于尼罗替尼(Novartis公司)不溶于水，需先配制1 mM的二甲基亚砜(DMSO)-尼罗替尼溶液，然后用培养液稀释成多个浓度(0、2、4、6、8、10 μM)。

1.2.5 细胞增殖和活力检测 将Schwann细胞和MPNST细胞培养于96孔平板中，每孔500个细胞，于37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h。随后使用上述不同浓度的尼罗替尼培养液培养，每天更换药物培养液。药物处理10 d后，分别使用Cell Proliferation-BrdU ELISA和XTT检测试剂盒(Roche公司)测定细胞增殖和活力。实验操作遵照试剂盒使用说明书，每个药物处理浓度重复6孔，计算药物半数抑制浓度(IC50)。

1.2.6 胶原酶活性测定 细胞在不同浓度的尼罗替尼处理24 h后，收集细胞培养液，利用胶原酶活性测定试剂盒(Chondrex公司)进行检测。利用FLx800荧光分析仪(BioTek公司)检测反应物荧光强度，激发光波长为490 nm，发射光波长520 nm。

1.2.7 MPNST细胞凋亡率检测 由于Schwann细胞生长较慢，数量较少，而流式细胞仪测定凋亡率需要较多细胞(约2×106cells/ml)，因此本研究只检测了3株MPNST细胞在药物处理后的凋亡率。利用尼罗替尼(0、2、6、10 μM)对细胞处理24 h后，采用Annexin-V-binding assay试剂盒和流式细胞仪(FACSCalibur)测定细胞凋亡率，利用Cell Quest软件分析数据(BD公司)。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行数据处理，计算半数抑制浓度(IC50)及其95%可信区间。

2 结果

2.1 细胞免疫荧光染色结果 Schwann细胞(图1a)和成纤维细胞(图1b)胞浆分别呈绿色和红色，细胞核则呈蓝色。10例PNF样本培养物的S100阳性细胞比例为(85.9±3.6)%。

图1 细胞免疫荧光染色结果 a：Schwann细胞；b：成纤维细胞

2.2 尼罗替尼对细胞增殖和活力的影响 尼罗替尼可抑制Schwann细胞和MPNST细胞的增殖和活力，抑制效果与药物的浓度成正比，IC50为2.3～10.8 μM。见表1。其中，MPNST细胞株S462对尼罗替尼最敏感，其增殖和活力的IC50最低，分别为3.1 μM和2.3 μM。

表1 尼罗替尼对细胞处理后的半数抑制浓度(IC50)和95%可信区间

2.3 尼罗替尼对胶原酶活性影响 部分PNF组织培养的Schwann细胞和2株MPNST细胞能够产生胶原酶，其活性高低具有个体差异性(图2)。尼罗替尼处理24 h后，胶原酶活性均显著下降，其中4 μM的尼罗替尼处理后，所有细胞的胶原酶活性降至1 U/ml以下；而10 μM的尼罗替尼可抑制所有细胞产生胶原酶。

图2 尼罗替尼对Schwann细胞和恶性周围神经鞘瘤细胞表达胶原酶的影响

2.4 MPNST细胞凋亡率 尼罗替尼处理24 h后，可诱导MPNST细胞的凋亡。细胞凋亡率的高低与药物浓度有关，其中6 μM尼罗替尼诱导细胞凋亡率为最高，而细胞在10 μM尼罗替尼处理后，凋亡率反而有所下降(图3)。

图3 尼罗替尼处理后恶性周围神经鞘瘤细胞的凋亡率 a：尼罗替尼(6 μM)对S462细胞处理后的流式细胞仪检测结果散点图，其中4个区域的散点分别表示：活细胞(左下)，早期凋亡细胞(右下)，晚期凋亡细胞(右上)，坏死细胞(左上)；b：3株MPNST细胞在尼罗替尼处理后的凋亡率

3 讨论

NF1是一种由NF1基因突变引起的常染色体显性遗传疾病，临床主要表现为皮肤咖啡牛奶斑和神经纤维瘤。PNF是神经纤维瘤的临床表现之一，NF1患者发生PNF者占30%～50%[5]。PNF根据病灶的部位和大小，可累及神经、骨骼、血管等多种组织，从而引起疼痛和容貌损害，神经、眼、骨骼及内脏病变，甚至进行性发展为恶性肿瘤-MPNST。手术切除是临床上治疗PNF的主要手段，但是由于PNF通常侵入临近的正常组织，难以彻底切除而极易产生复发，目前也尚无有效的药物可用于临床PNF的治疗[6]。

我们前期的研究发现血小板衍生生长因子受体(PDGFR)和c-KIT在神经纤维瘤组织和PNF组织培养的Schwann细胞中高表达；而受体酪氨酸激酶抑制剂-伊马替尼(格列卫)，在体外能够有效抑制Schwan细胞活力和PNF动物模型中肿瘤的生长[7]。但是，近期有2期临床试验研究表明，伊马替尼对PNF患者的有效率只有20%左右[8]。

尼罗替尼是一类基于伊马替尼的新型肿瘤化疗药物，目前临床上主要用于治疗伊马替尼耐药或不耐受的费城染色体阳性的慢性髓性白血病。本研究通过体外试验，探索尼罗替尼对PNF组织培养的Schwann细胞和MPNST细胞生长特性的影响，以评价尼罗替尼治疗PNF的价值。研究结果表明，尼罗替尼在体外可有效抑制Schwann细胞和MPNST细胞的增殖和活力，但是具有个体差异性，其IC50为2.3～10.8 μM。前期有研究检测慢性髓性白血病患者口服400 mg/d的尼罗替尼后，血浆药物峰浓度为(4.27±1.47) μM，与本研究发现的尼罗替尼抑制细胞增殖的IC50相近，因此研究结果具有临床相关性。

胶原酶是基质金属蛋白酶家族成员之一，也是构成细胞外基质(ECM)的主要成分，在正常组织中一般表达较低，而在组织修复、伤口愈合和肿瘤中高表达。肿瘤中胶原酶的高表达主要是由于肿瘤细胞可以产生或者诱导宿主细胞产生胶原酶，从而利于肿瘤细胞的侵袭和转移[9]。本研究发现部分Schwann细胞和MPNST细胞可产生胶原酶，其培养液中胶原酶活性表达增高。尼罗替尼处理后可降低所有细胞的胶原酶活性，证明了药物的抗肿瘤作用。此外，本研究还发现尼罗替尼可诱导MPNST细胞的凋亡，而细胞在10 μM尼罗替尼处理后，凋亡率反而降低，可能是由于高浓度药物产生的细胞毒作用所致。

综上所述，本研究表明尼罗替尼在体外可有效抑制PNF肿瘤组织培养的Schwann细胞和MPNST细胞增殖、活力和胶原酶的表达，诱导MPNST细胞的凋亡，具有潜在的临床应用价值，值得进一步开展体内试验和作用机制研究。

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Application of nilotinib to neurofibromatosis type 1-associated tumors in vitro

JIANG Wei1，HUANG Wen-fang1，Claudia Schnabel2a，Lan Kluwe2a，Victor-F.Mautner2a，Reinhard E.Friedrich2b，Andreas Kurtz3

(1.Department of Laboratory Medicine，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China；2.a.Department of Neurology；b.Oral and Maxillofacial Surgery，University Medical Center Hamburg-Eppendorf，Hamburg 20246，Germany；3.Brandenburg Center for Regenerative Medicine，Charité-Medical University，Berlin 10117，Germany)

Objective To investigate the effect of nilotinib on plexiform neurofibroma(PNF)-derived Schwann cells and malignant peripheral nerve sheath tumor(MPNST)cells in vitro.Methods The Schwann cells cultured from 10 PNF tissues and 3 established MPNST cell lines were treated by nilotinib with different concentrations.Cell proliferation，viability，apoptosis and collagenase activity were detected to evaluate drug efficacy.Results Nilotinib treatment led to decreased cell proliferation and viability with 50% inhibitory concentration(IC50)varying from 2.3 to 10.8 μM.In addition，nilotinib induced MPNST cell apoptosis and suppressed collagenase activity.Conclusion Nilotinib is able to inhibit proliferation and viability of PNF-derived Schwann cells and MPNST cells in vitro.It is worth performing further in vivo studies and the researches underlying mechanisms of the effects.

Nilotinib；Neurofibromatosis type 1；Plexiform neurofibroma；Malignant peripheral nerve sheath tumor；In vitro study

R739.43

A

1672-6170(2015)05-0065-04

2015-05-27；

2015-07-16)