山西晋城马铃薯疮痂病病原菌鉴定

王丹 ，姚晓东，李新凤，王美琴，郝晓娟，王建明

（山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

山西晋城马铃薯疮痂病病原菌鉴定

王丹 ，姚晓东，李新凤，王美琴，郝晓娟＊，王建明

（山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

为分离鉴定山西晋城马铃薯疮痂病病原菌，对分离物进行致病性测定、形态学观察、生理生化特性测定及16S rDNA序列分析。结果表明，该分离物在燕麦培养基上菌落呈灰白色，边缘稍有褶皱突起，显微观察孢子呈灰色，孢子链呈螺旋状，结合生理生化特性测定结果将其鉴定为Streptomycesscabies。该菌株与Streptomycesscabies（登录号为HM018114)的16SrDNA序列同源性为100%。引起山西晋城马铃薯疮痂病的病原菌为Streptomycesscabies。

马铃薯疮痂病;病原菌鉴定;链霉菌;16SrDNA序列

作为全球四大粮食作物之一［1］，马铃薯具有较高的营养及药用价值，在人们消费结构中的地位越来越重要［2］。但其易被多种病原菌感染，影响地上及地下组织器官正常生长。由链霉菌属引起的马铃薯疮痂病（potato scab)在各种植区发生普遍［3］，对马铃薯品质及市场经济价值造成了严重影响［4］。国内外学者对引起该病害的病原菌种类进行研究，发现引起马铃薯疮痂病病原菌种类因不同国家和地区而异，具有明显的区域特性和遗传多样性［5～7］。法 国 已 报 道 病 原 菌 主 要 是Streptomyces.reticuliscabiei、S.steliiscabiei［7］;在芬兰发现的疮痂病原菌有S.turgidiscabies、S.aureo-faciens、S.scabies等［8］;在加拿大东部地区，主要的疮痂病病原为S.scabies、S.acidiscabies［9］;S.luridiscabiei、S.niveiscabiei、S.puniciscabiei等在韩国被报道［10，11］。张 萌［6，12，13］等 对 来 自 中 国 不 同 地区的马铃薯疮痂病菌进行了遗传多样性分析和区域分布特性研究，结果表明S.bobili和S.galilaeus主要分布于内蒙古自治区、河北、山西等省，S.curopacisabiei和S.scabies主要分布于河北、黑龙江等省，在云南、四川等省发现了S.scabies，来自山东的疮痂病原有S.diastato-chromogenes、S.acidiscabies、S.setonii等。目 前 对 山 西省马铃薯疮痂病病原菌种类的报道较少。为明确山西晋城马铃薯疮痂病原菌种类，本试验对从该地区采集到的马铃薯疮痂病病薯进行了病原菌的分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 病薯症状观察及病原菌的分离

2014年5月从山西晋城马铃薯种植区采集马铃薯疮痂病病薯，对其症状进行观察。

将病薯块茎带回实验室用蒸馏水清洗，经3%的NaClO溶液进行表面消毒后用无菌水清洗，晾干。向无菌研钵中加20mL 1∶140的苯酚溶液，取小块病健交界处组织于研钵中研碎，浸泡10min，取20μL涂在大豆葡萄糖琼胶平板上（大豆粉5.0g，葡萄糖5.0g，CaCO30.4g，琼脂粉17.0g，蒸馏水1 000mL，pH8.0)，于30℃恒温培养5d［14］。挑取单菌落于燕麦培养基（燕麦片20g，琼脂粉18g，蒸馏水1 000mL，pH7.2)上进行划线培养，经3次纯化培养后刮取培养7d的孢子配成悬浮液，20%甘油－20℃保存。

1.2 致病性测定

采用 Tuber slice assays法［15］，选取健康马铃薯，经0.5%的NaClO溶液表面消毒和无菌水清洗后晾干，用15mm的打孔器从马铃薯的中心打取接种组织，将圆柱形接种组织切成厚度为3mm的圆片，置于含有三层无菌滤纸保湿的培养皿中，用6mm的打孔器打取经OMA培养基培养7d的待测菌的菌饼，接种于马铃薯薄片中心，以空白菌饼作为对照。于30℃恒温条件下培养，分别于7d、14d时观察病斑情况。

1.3 病原菌形态观察

挑取在燕麦培养基平板生长7d的菌落于载玻片上，100倍光学显微镜下观察孢子及孢子链特征［16］。

1.4 生理生化特性测定

参照伯杰细菌鉴定手册［17］和链霉菌鉴定手册［18］中测定方法，对该菌株进行碳源利用、氮源利用、黑色素产生、硫化氢产生、淀粉利用和敏感性等方面测定。

1.5 16S rDNA序列扩增及同源性分析

1.5.1 基因组的提取

参考刘炳辉［19］等优化SDS法来提取该菌株基因组DNA。

1.5.2 16SrDNA PCR扩增

选取16SrDNA通用扩增引物进行PCR扩增。引物（Primer)序列：

反应条件：94℃预变性4min;94℃变性30s;55℃退火30s;72℃延伸90s;共32个循环。72℃最后延伸10min，4℃保存。

将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并送至上海生工进行测序。得到的拼接序列在NCBI作BLAST比对，构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病薯症状描述

病原菌侵染造成马铃薯块茎病部表皮粗糙，有裂缝。病斑组织木栓化、坏死，表面呈棕褐色凸起疮痂（图1-A)。

2.2 致病性测定结果

采用小薯片法对代表菌株JC-1进行致病性测定，接种7d后，该菌株可在接种体上扩展生长，菌饼周围可观察到轻微褐变;14d后，可观察到明显褐变和坏死。

2.3 病原菌形态特征

JC-1菌株在燕麦琼脂培养基平板上菌落呈灰白色，边缘稍有褶皱突起（图1-B)。革兰氏染色呈阳性，孢子呈灰色，孢子链呈螺旋状（图1-C)。

图1 病害症状及病原菌形态观察Fig.1 Symptoms of potato scab and morphological characteristic of isolated strain

2.4 生理生化特性测定结果

JC-1菌株能够以果糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、棉籽糖、肌醇等碳源为单一碳源。能以甲硫氨酸、组氨酸为单一氮源。对链霉素、青霉素、结晶紫均敏感。能使ISP6培养基变黑，表明可产生黑色素。能使Tresner培养基变黑，证明可产生H2S。可产生淀粉水解酶。符合Streptomycesscabies生理生化特性（表1)。

2.5 16S rDNA序列分析结果

扩增得到分子量约1 500bp的16SrDNA片段（图2)。在NCBI进行序列比对，在以Actinomycesnaturae（登录号为FJ234421)为外群，使用MEGA5.05软件构建的系统发育树中（图3)，待测菌株JC-1与Streptomycesscabies（登录号为HM018114)同源性为100%。16SrDNA序列分析证明该菌株为Streptomycesscabies，与形态学鉴定结果一致。

表1 马铃薯疮痂病菌JC-1生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the pathogen of potato scab

3 结论与讨论

马铃薯疮痂病是马铃薯的重要病害之一，给马铃薯的品质造成极大影响，通常使马铃薯减产10%～30%［20］。本研究从病原菌的培养物特征、显微形态、生理生化特性等方面进行生物学研究，并结合16SrDNA序列分析，将山西晋城地区马铃薯疮痂病病原菌鉴定为疮痂链霉菌Streptomyces scabies。

图2 PCR扩增检测结果（M：Marker;1：JC-1菌株基因组扩增产物)Fig.2 The results of PCR amplification for 16SrDNA sequences（M：Marker;1：PCR products of the strain JC-1)

图3 基于16SrDNA基因序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16SrDNA sequences of the scab-related strain

山西马铃薯产业在促进山西经济发展，农民收入增加方面有重要意义，本研究采集的病薯来自于晋城，今后还应进一步调查山西省不同马铃薯种植地区马铃薯疮痂病的情况，采集并进行病原菌分离鉴定，为有效防治该病害以及探究马铃薯疮痂病菌遗传多样性提供可靠依据。

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Identification of The Pathogen of Potato Scab in Jincheng of Shanxi Province

Wang Dan，Yao Xiaodong，Li Xinfeng，Wang Meiqin，Hao Xiaojuan＊，Wang Jianming
（CollegeofAgriculture，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China)

The pathogen causing potato scab in Jincheng of Shanxi province was isolated and identified.The isolated strain from potato scab was analyzed and identified by pathogenicity identification，morphological observation，determination of physiological and biochemical characteristics and the analysis of 16SrDNA sequence.The colony of isolate was grey，which showing wrinkle and bulge on the edge of the colony.Conidium were grey and spore chains were spiral.According to morphological features and the charactersitics of physiology and biochemistry，the isolate was identified asStreptomycesscabies.The results of 16SrDNA sequences of the isolated strain showed 100%identity withStreptomycesscabies（HM018114).The results showed that the pathogen causing scab in Jincheng of Shanxi province wasStreptomycesscabies.

Potato scab;Pathogen identification;Streptomyces;16SrDNA sequence

S435.32

A

1671-8151（2015)05-0495-04

10.13842/j.cnki.issn1671-8151.2015.05.009

2015-03-30

2015-04-18

王丹（1988-)，女（汉)，山西运城人，硕士研究生，研究方向：生物农药与生物防治

＊通讯作者：郝晓娟，副教授，硕士生导师。Tel：0354- 6286806;E-mail：xiaojuanhao＠126.com

国家自然科学基金青年基金（31000873);山西农业大学中青年学术骨干基金（XG201210);山西省科技攻关项目（20120311016-2)

（编辑：武英耀)