长叶点地梅叶片愈伤组织诱导影响因子分析

摘 要：以长叶点地梅（Androsace longifolia）无菌实生苗为试验材料，研究植物生长调节剂、大量元素、琼脂、蔗糖、暗处理等因子对长叶点地梅愈伤组织诱导的影响。结果表明，2，4-D更适合长叶点地梅叶片愈伤的诱导，诱导愈伤组织最适宜的培养基是MS基本培养基附加1.0 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂，诱导率为95.0%；暗处理不利于长叶点地梅叶片愈伤的诱导。

关键词：长叶点地梅；愈伤组织诱导；影响因子

中图分类号：Q813 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.031

Abstract： Taking Androsace longifolia sterile seedlings as experimental materials， the effects of plant growth regulator， macroelement， agar， sugar and dark treatment on Androsace longifolia blade callus induction was studied. The results showed that 2，4-D better suited to Androsace longifolia blade callus induction， the most suitable medium was MS basic medium supplemented with 1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.2 mg·L-1 6-BA + 3% sucrose + 0.8% agar， induction rate was 95.0%； dark treatment was not conducive Androsace leaf callus induction.

Key words： Androsace longifolia； callus induction； impact factor

长叶点地梅（Androsace longifolia） ，为报春花科点地梅属的多年生草本花卉，生于多石砾的山坡，岗顶和砾石质草原，对生境要求低，适应性强，具有较好的耐践踏性，是一种良好的园林地被植物。其植株低矮，花朵娇小，花色清新，东北地区的花期在5月份左右[1]，是该地区难得的早春花卉，具有很高的观赏价值。据报道点地梅属植物具有一定药用价值[2-8] ，可以显著提高人肝癌细胞抗增殖活性等[9]，长叶点地梅的园林开发应用极少，多处于野生状态，对其相关研究鲜有报道。目前，对报春花科报春花属的植物组织培养研究的较多，点地梅属植物组织培养方面的研究迄今很少。聂勇[10]以点地梅[A.umbellate（Lour.）Merr.]无菌苗的嫩叶为外植体，研究了不同质量浓度下的2，4-D和6-BA对愈伤组织诱导的影响。张彦妮等[11-12]对长叶点地梅愈伤组织的诱导和植株的再生以及细胞悬浮培养的条件进行了研究。但这些文献均未对长叶点地梅叶片愈伤组织诱导的影响因子进行较为全面的研究。

愈伤组织是指在培养或自然条件下，植物细胞脱分化不断增殖所产生的主要由薄壁细胞构成的组织。其诱导成功与否影响到组织培养后续的研究。研究表明，愈伤组织的形成除了与创伤有关外，还主要与植物内源或外源的激素有关[13]。因此，在愈伤组织诱导的过程中，植物生长调节剂的种类和浓度最为重要，研究最完善。然而，影响外植体愈伤诱导的因素诸多且少有系统分析，尤其忽略了大量元素、琼脂浓度、碳源及暗处理等条件在愈伤诱导过程中的影响。本研究探讨植物生长调节剂、大量元素 、琼脂浓度、碳源及暗处理对长叶点地梅叶片诱导愈伤组织的影响，以期进一步完善长叶点地梅组培快繁技术体系。

1 材料和方法

1.1 材 料

长叶点地梅无菌实生苗。

1.2 方 法

1.2.1 6-BA 与NAA2，4-D组合对长叶点地梅叶片诱导愈伤的影响 将长叶点地梅无菌实生苗的叶片切成0.5 cm2左右的小块，接入不同浓度2，4-D和6-BA组合及NAA和6-BA组合的MS培养基（表1）上，每种培养基接种30个外植体。30 d后，统计叶片的诱导率、愈伤的长势等指标。

1.2.2 大量元素对叶片诱导愈伤的影响 以长叶点地梅叶片为外植体，根据1.2.1试验结果，确定激素浓度配比，探究大量元素对叶片诱导愈伤的影响，培养基类型分别为MS、1/2MS、1/4MS，每种培养基接种20个外植体，30 d后，统计分析诱导率及愈伤长势等。

1.2.3 碳源、琼脂、暗处理对叶片诱导愈伤的影响 以1.2.1与1.2.2结果，确定培养基种类，以长叶点地梅叶片为外植体（20个），比较不同碳源（蔗糖、麦芽糖、葡萄糖）、琼脂浓度（分别为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 g·L-1）、暗处理（7，14，21 d）等因素对叶片愈伤诱导的影响，30 d后，统计分析诱导率及愈伤长势等。

2 结果与分析

2.1 6-BA与 NAA或2，4-D组合对长叶点地梅叶片诱导愈伤的影响

结果表明（图1），2，4-D与6-BA组合中，在M4的培养基上，叶片诱导愈伤的效果最佳，诱导率高达83.3%；与6-BA组合中，最佳培养基为N3，诱导率为53.3%。当各组合中激素配比相同时，2，4-D和6-BA组合的诱导率均高于NAA和6-BA的组合，这表明，2，4-D提高叶片的愈伤诱导率的效果更佳。此外，在M4与N3的培养基中，愈伤启动期分别为13，12 d，差距不大；愈伤组织的形态指标相似，均呈淡绿色，结构疏松（图2，图3），这表明，两种培养基均能在较短的时间内得到分化能力较好的愈伤组织。因此，叶片诱导愈伤最佳激素配比为M4，即1.0 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 6-BA，与NAA相比，2，4-D更利于长叶点地梅叶片愈伤组织的诱导。

2.2 大量元素对叶片诱导愈伤的影响

大量元素是生物生长所需的必备元素，不同植物对大量元素含量的要求不同，大量元素对叶片诱导愈伤具有重要影响。试验结果表明，长叶点地梅叶片诱导愈伤的最适培养基为MS（图4）。随着大量元素浓度的降低，叶片愈伤组织的诱导率呈下降趋势。在MS培养基上诱导率达95%，产生的愈伤最多，愈伤组织呈淡绿色，质量大于0.6 g，长势最好；1/4MS培养基上的叶片愈伤组织诱导率仅为50%，愈伤组织质量小于0.3 g，长势最差。

2.3 碳源、琼脂、暗处理对叶片诱导愈伤的影响

培养基中的琼脂除有固化作用外，也会吸附外植体的代谢产物，因此不同浓度的琼脂对外植体的生长有不同程度的影响。结果（图5）表明：琼脂浓度对诱导率有较大的影响，愈伤组织诱导率在一定琼脂浓度内升高，当琼脂浓度达到8.0 g·L-1时，诱导率达到最大值95%。启动期不受琼脂浓度的影响，随着琼脂浓度变化，叶片愈伤的启动期均保持在13～15 d。形态指标上，当琼脂浓度为5.0 g·L-1时，培养基呈半固体状态，愈伤组织质地疏松，长势不佳。随着琼脂浓度逐渐增加，愈伤组织的长势越来越好，琼脂浓度为8.0 g·L-1时，愈伤组织呈浅绿色，长势最好。当琼脂浓度为9.0 g·L-1时，愈伤组织颜色加深，质地相对紧实，长势不佳。这表明琼脂在高浓度的条件下，培养基硬度加强，不利于外植体对营养物质的吸收。因此，长叶点地梅叶片诱导愈伤最佳琼脂浓度为8.0 g·L-1。

不同植物材料对碳源的吸收状况不同，因此对碳源种类的要求也不同。培养基上添加浓度均为3%的麦芽糖、葡萄糖，结果（图6）发现：蔗糖作为碳源时诱导的愈伤最佳，诱导率达90%，愈伤组织的生长状况最好，产生愈伤组织较多。诱导率最低的为葡萄糖，产生的愈伤较少。3种碳源的混合效果与单一碳源的作用效果相差不大。在各组合中，愈伤诱导效果最佳的是50%蔗糖与50%麦芽糖混合，诱导率为61.0%，比单一使用麦芽糖、葡萄糖时有较小程度的提高，但低于单独使用蔗糖时的诱导率，因此长叶点地梅愈伤组织诱导蔗糖为最佳碳源，不宜使用混合碳源。

将外植体进行不同时间的暗处理后发现：暗处理4 d后，叶片开始变黄，暗处理7 d后移至光下培养，光下培养14 d后开始产生愈伤，诱导率仅为5%，愈伤组织呈黄绿色，长势一般，叶片切口处有褐化发生，且培养基受到褐化物质的污染。叶片在暗处理14 d和21 d后，均无愈伤组织产生，且叶片失绿，外植体变黑褐色死亡。因此，长叶点地梅叶片诱导愈伤时不适合进行暗处理。

3 结论与讨论

目前，长叶点地梅在组织培养方面的研究较少，仅局限于生长调节剂的种类及浓度。植物愈伤组织的诱导、增殖及形态建成主要受外植体本身、培养基和培养环境等3大因素的调控[14]，但少有人对其系统地比较研究。本试验对生长调节剂、大量元素 、琼脂浓度、碳源及暗处理对长叶点地梅叶片诱导愈伤组织的影响进行了研究，发现长叶点地梅叶片诱导愈伤的最佳培养基为MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂，诱导率达95.0%。一般认为，NAA更利于芽的增值，2，4-D在愈伤组织的诱导过程中较为常用，本研究也得到相似结论，认为2，4-D更适合长叶点地梅叶片诱导愈伤，可以提高愈伤组织诱导率。时永杰等[15]以白羊草（Bothriochloa ischaemum）幼穗为外植体进行组织培养，发现在暗光培养条件下，更利于愈伤组织的产生与生长。本试验将叶片先进行不同时间的暗处理（7，14，21 d），再置于光下诱导愈伤，结果却发现，暗处理不利于长叶点地梅叶片对愈伤的诱导。差异的产生可能是由于不同植物材料对光照的要求不同，也体现了本研究对暗处理这一条件探究的意义。

以上研究结果表明，生长调节剂、琼脂浓度及暗处理，不仅对长叶点地梅叶片诱导愈伤的数量有影响，而且也影响所诱导愈伤的质量。愈伤组织的质量是影响长叶点地梅再生的关键性因素，一般情况下，淡绿色疏松的愈伤组织质量较好，分化能力较强，而其他因子只对诱导率即愈伤组织的数量有较大的影响。本研究通过对生长调节剂、大量元素 、琼脂浓度、碳源及暗处理等因子影响长叶点地梅叶片诱导愈伤的的探索，为进一步完善长叶点地梅组培快繁体系奠定了基础。

参考文献：

[1] 柳参奎. 中国东北盐碱地植物原色图鉴[M]. 哈尔滨： 东北林业大学出版社， 2006： 123.

[2] 李承花， 殷志琦， 黄晓君， 等. 点地梅的化学成分[J]. 中国天然药物， 2008， 6（2）： 123.

[3] 雷军， 肖云川， 王文静， 等. 点地梅中的黄酮苷成分[J]. 中国中药杂志， 2011， 36（17）： 2353.

[4] 王文静， 雷军， 肖云川， 等. 点地梅中双黄酮类化学成分的分离和鉴定[J]. 华西药学杂志， 2011， 26（5）： 420.

[5] Lei J， Xiao Y C， Huang J， et al. Two new kaempfero lglycosides from Androsace umbella-ta[J]. Helv Chim Acta， 2009， 92（7）： 1 439.

[6] Dong W， Liu X， Li X， et al. A new triterpene saponinfrom Androsace integra[J]. Fitotera-pia， 2011， 82（5）： 782.

[7] Park J H， Kwak J H， Khoo J H， et al. Cytotoxic effects of triterpenoid saponins from Androsace umbellate against multidrug resistance（MDR） and non-MDR cells[J]. Archives of Pharmacal Research， 2010， 33（8）： 1 175.

[8] Wang Y， Zhang D， Ye W， et al. Triterpenoid saponins from Androsace umbellata and their anti-proliferative activities in human hepatoma cells[J]. Planta Med， 2008， 74 （10）： 1 280.

[9] 黄先丽， 王晓静， 贾献慧. 点地梅的挥发油成分分析[J]. 食品与药品， 2009， 11（3）： 37.

[10] 聂勇. 2，4-D和6-BA对点地梅愈伤组织诱导的影响[J]. 阿坝师范高等专科学校学报，2006， 23（4）： 127-128.

[11] 张彦妮， 陈素波. 长叶点地梅愈伤组织诱导和植株再生[J]. 草业科学， 2012， 29（6）： 931-936.

[12] 张彦妮， 陈素波. 长叶点地梅愈伤组织诱导和植株再生[J]. 草业科学， 2014， 31（8）： 1 481-1 486.

[13] 姚敦义.植物形态发生学[M].北京：高等教育出版社，1994：42，95.

[14] 谷瑞升， 蒋湘宁， 郭仲琛. 植物立体培养中器官发生调控机制的研究进展[J]. 植物学通报 ， 1999， 16（3）： 1-4.

[15] 时永杰 ， 孙晓萍， 刘晓强. 白羊草幼穗的组织培养[J]. 草业科学， 1998（12）： 19-20.