多蒴曲尾藓提取液的抑真菌活性

刘俊华+李玉玺+马海玲

摘要：采用菌丝生长速率法和孢子萌发2种方法，分析比较了药用植物多蒴曲尾藓配子体提取液对植物病原真菌大茎点霉的抑菌活性。结果表明：在质量浓度为120 g/L时，无菌水和80%乙醇2种溶剂藓体提取液对大茎点霉菌丝生长的抑菌率均达60%以上，其中乙醇提取液的抑菌作用较强，抑菌率为67.47%，EC50 值为27.28 g/L;乙醇提取液对大茎点霉菌孢子萌发的抑菌活性高于对其菌丝生长的抑菌活性，EC50值为19.62 g/L，抑制作用优于水提液。多蒴曲尾藓对大茎点霉具有良好的抑菌效果，在冬枣轮纹病生物防治方面具有一定的开发潜力和应用价值。

关键词：多蒴曲尾藓提取物;抑菌活性;大茎点霉;抑菌中浓度

中图分类号： S482.2+92 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0141-02

收稿日期：2014-05-11

基金项目：国家级大学生创新创业训练计划 （编号：201210449111）;滨州学院自然科学基金（编号：BZXYLG200701）。

作者简介：刘俊华（1980—），男，山东高唐人，硕士，讲师，主要从事植物生态学教学与研究。Tel：（0543）3191727;E-mail：liujh1980@126.com。

植物病原真菌对农作物的危害较严重，寻求环境兼容性好、安全、低毒、经济的植物源农药控制真菌引起的农作物病害已成为一种趋势[1]。我国拥有十分丰富的植物资源，且相当多的物种具有药用价值。多蒴曲尾藓（Dicranum majus Turn.）为曲尾藓科（Dicranaceae）曲尾藓属（Dicranum Hedw.）植物[2]，是广泛分布于我国的一种常见药用藓类，其体内富含多种氨基酸[3]。据中医古籍记载，该藓全草入药，气微，味淡，有清肺止咳功效，多用于治疗肺热咳嗽[3]，在我国民间多有使用，但有关其抑菌活性方面的研究尚未有文献报道。

本研究以山东省内山区采集的多蒴曲尾藓配子体为试材，以冬枣轮纹病致病菌大茎点霉菌[4]为受试菌株，利用其配子体水提液、醇提液进行抑制菌丝生长和孢子萌发研究，旨在初步阐明多蒴曲尾藓抑制真菌活性，为开发以多蒴曲尾藓为植物源的杀菌剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用多蒴曲尾藓配子体，采自山东省境内鹤伴山区林下阴湿岩面。野外采集带回室内，用清水洗净后自然风干，研磨成粉，冷藏备用。供试菌株为大茎点霉菌（Macrophoma kuwatsukaii），系冬枣轮纹病的病原菌，由滨州学院生物学实验教学中心提供。

1.2 方法

1.2.1 提取液的制备 准确称取多蒴曲尾藓配子体干粉12 g 放入250 mL锥形瓶中，加入80%乙醇作为提取溶剂，置于50 ℃恒温水浴锅内浸提24 h。以4 000 r/min 离心 15 min，收集上清液即为浸提液，定容至100 mL，得浓度为120 g/L的提取母液。然后依次稀释得到浓度为60、30、15、7.5、3.75 g/L的多蒴曲尾藓提取液;同样方法制备得到多蒴曲尾藓配子体水提液，均于4 ℃冰箱内保存备用。

1.2.2 含药培养基的制备 将上述配制好的提取液分别加入到盛有30 mL PDA培养基的培养皿（直径90 mm）中制成含药（藓体提取液）培养基;同时，以加入相同体积无菌水、80%乙醇PDA培养基作为对照。

1.2.3 菌丝生长速率法测定提取液抑菌活性 按菌丝生长速率法计算抑菌率。待菌丝即将长满整个培养皿时，在菌丝生长旺盛处用打孔器打取直径为6 mm的菌饼，接种于带药液培养基中心位置，每皿接1个菌饼，每个浓度接种3皿（即每处理3个重复）;置于37 ℃的恒温培养箱中培养。48 h 后，观察大茎点霉菌的生长情况，用游标卡尺以“十”字交叉法测量菌落直径（精确至0.1 mm）。抑菌率计算公式如下：

抑菌率=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-6 mm）]×100%。

1.2.4 稀释平板计数法测定提取物对大茎点霉菌孢子萌发的抑制率 吸取前期活化并制备好的菌悬液，分别加入到上述不同质量浓度的培养基中，用涂菌棒涂布均匀后静置20 min，再将培养基平板倒置，于37 ℃生化培养箱培养24 h;准确记测菌落数。对照组（分别以无菌水培养和80%乙醇培养）菌落数记为C0，涂布提取物平板菌落数记为C，按下式计算孢子萌发抑制率：抑制率=[（对照萌发率-处理萌发率）/（对照萌发率）]×100%=[（C0-C）/C0]×100%。

1.3 数据的处理与分析

采用Excel 2003及SPSS 18.0 进行数据整理与统计分析，采用Duncans 新复极差法进行组间差异显著性检验;运用提取物对大茎点霉菌菌丝生长及孢子萌发影响的回归方程，计算相应EC50值。

2 结果与分析

2.1 多蒴曲尾藓提取物对大茎点霉菌菌丝生长的抑制作用

由表1可知，多蒴曲尾藓水提液和醇提液对大茎点霉菌菌丝生长均具有一定的抑制作用，在质量浓度为3.75 g/L时，菌丝生长抑制率分别为10.45%和13.85%，抑菌活性随提取液浓度提高而增强，质量浓度至120 g/L时，2种提取液抑制率均达到60%以上，分别为62.92%和67.47%。同时，从菌丝生长情况来看，处理组与对照组相比，菌落直径明显减小，菌丝稀疏、纤细，且易老化。

表1 多蒴曲尾藓提取物对大茎点霉菌菌丝生长的抑制作用

质量浓度

（g/L）

菌环直径（mm） 平均抑制率（%）

水提液 醇提液 水提液 醇提液

120 26.2±3.37a 29.9±4.10a 62.92±5.08a 67.47±4.17aendprint

60 29.6±3.60a 32.8±5.00a 59.33±6.19a 63.29±4.47a

30 36.9±2.90a 36.7±4.55b 54.58±5.64a 54.20±3.60b

15 43.4±3.97b 46.1±3.56c 42.90±4.41b 46.13±4.93c

7.5 54.8±3.76c 57.5±4.29d 28.82±5.31c 32.04±4.66d

3.75 69.5±3.48d 72.3±5.10e 10.45±6.32d 13.85±4.32e

0（CK） 80.6±2.74e 80.7±3.06f 0e 0f

注：表中数据为平均值±标准差，同列数据小写字母表示不同质量浓度处理间差异显著（P<0.05）。表2同。

由图1可知，提取液质量浓度与抑菌率间呈正相关关系，其中水提液抑菌力回归方程为y=15.069lnx-2.864 3（r2=0.922 7，P=0.077），醇提液抑菌力回归方程为y=15248lnx-0.413 7（r2=0.951，P=0.057）;进一步计算得到2种提取液对大茎点霉菌菌丝生长的EC50值，分别为27.61 g/L（水提液）、27.28 g/L（醇提液）。

2.2 多蒴曲尾藓提取物对大茎点霉菌孢子萌发的抑制作用

植物病原菌在萌发阶段对外来药剂较为敏感，且其孢子萌发率随药液浓度增大呈明显下降趋势。由表2可知，多蒴曲尾藓对大茎点霉菌孢子萌发具有较强的抑制作用，且随着提取液质量浓度的增高，抑制作用显著增强。

表2 多蒴曲尾藓提取液对大茎点霉菌孢子萌发的抑制作用

质量浓度

（g/L）

菌落数（个） 平均抑制率（%）

水提液 醇提液 水提液 醇提液

120 4.7±2.08a 2.7±1.53a 83.53±2.08a 89.61±1.53a

60 7.7±2.52ab 6.3±1.53b 72.94±2.52ab 75.32±1.53b

30 11.7±2.08b 10.7±2.08c 58.82±2.08b 58.44±2.08c

15 16.3±2.52c 14.0±2.00c 42.35±2.52c 45.45±2.0c

7.5 21.0±2.65d 18.3±1.53d 25.88±2.65d 28.57±1.53d

3.75 25.3±2.08e 22.3±2.52e 10.59±2.08de 12.99±2.52e

0（CK） 28.3±3.51e 25.7±2.52e 0e 0e

由图2可知，醇提液对大茎点霉菌孢子萌发的抑制作用略强于水提液。通过对提取液质量浓度与孢子萌发抑制率间进行回归分析，得到水提液和醇提液与孢子萌发抑制率间的回归方程，分别为：y=22.108lnx-15.801（r2=0.995 4，P=0.022）、y=21.531lnx-16.751（r2=0.999 1，P=0014），依方程计算得2种提取液抑制大茎点霉菌孢子萌发的EC50值，分别为22.20 g/L、19.62 g/L。

3 结论与讨论

本研究结果表明：多蒴曲尾藓提取液对冬枣轮纹病致病菌大茎点霉的生长具有较强的抑制作用，在供试质量浓度120 g/L时，多蒴曲尾藓提取液对大茎点霉菌的抑制率均在60%以上，对孢子萌发的抑制率达80%以上，其抑菌活性随质量浓度的增大而增强，且在中高浓度下（30～120 g/L）2种提取液大茎点霉菌孢子萌发的抑制率高于对其菌丝生长的抑制率。无论对大茎点霉菌菌丝生长还是孢子萌发，相对于无菌水提取液，乙醇提取液均表现出更强的抑制作用（表1、表2）。

苔藓植物能够产生如萜类、黄酮类、脂肪酸等次生代谢产物及一些生物活性物质，是潜在的天然活性产物宝库[5-9]。目前，已有多种苔藓植物被证明有抑制微生物活性的作用[5-6，8-10]，从苔藓植物中筛选抗菌、防腐、抗癌、防治心血管疾病、抗凝血和降血脂等药物将具有广阔的前景。

本研究初步阐明了多蒴曲尾藓对冬枣轮纹病致病菌的抑菌作用，但其抑菌机制尚不明了。同时，由于本试验只测定了

其粗提液的抑菌活性和EC50，对其抑菌主效成分尚不清楚，仍需围绕上述问题开展深入研究，为开发能有效应用于冬枣轮纹病生物防治的植物源杀菌剂提供理论基础与技术支持。

参考文献：

[1]赵成爱，杨琳琳，余梅燕，等. 八宝景天叶乙醇提取物的抑真菌活性[J]. 农药，2012，51（7）：536-538.

[2]赵遵田，曹 同. 山东苔藓植物志[M]. 济南：山东科学技术出版社，1998：90-107.

[3]国家中医药管理局中华本草编委会. 中华本草：第四卷[M]. 上海：上海科学技术出版社，1999.

[4]靳雅君，张泽勇. 冬枣轮纹病的发生与防治[J]. 北京农业，2006（9）：31.

[5]娄红祥. 苔藓植物化学与生物学[M]. 北京：北京科学技术出版社，2006：1-363.

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[7]吴鹏程. 苔藓植物生物学[M]. 北京：科学出版社，1998：148-203.

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[9]汪 庆，罗 宣. 苔藓植物的主要次生代谢产物与有害生物防治[J]. 贵州科学，2001，19（4）：93-100.

[10]刘俊华，王书平. 黄牛毛藓（Ditrichum pallidum）抑菌效果的生物测定[J]. 湖北农业科学，2010，49（2）：361-362.endprint