柴芩承气汤对急性坏死性胰腺炎小鼠肺HSP70表达及肺病理改变的影响*

程征宇 王明华 罗榕 祝华 苏静

(峨眉山市人民医院消化内科， 四川 峨眉山 614200)

柴芩承气汤对急性坏死性胰腺炎小鼠肺HSP70表达及肺病理改变的影响*

程征宇 王明华 罗榕 祝华 苏静

(峨眉山市人民医院消化内科， 四川 峨眉山 614200)

目的 探讨柴芩承气汤(Chai Qin Cheng Qi Decoction，CQCQD)对急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)小鼠肺热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)表达及肺病理评分的影响。方法 将30只昆明小鼠随机分成对照组、ANP组及CQCQD组各10只。ANP模型采用8%L-精氨酸溶液腹腔注射，4.0mg·g-1·1h-1×2制作。CQCQD组予以CQCQD制剂0.1ml/10g灌胃，1次/2h，观察其第6h的肺HSP70表达及肺病理评分变化。结果 ANP组HSP70表达(0.93±0.03)与对照组(0.81±0.09)相比较，表达明显无明显改变(P>0.05)，CQCQD组HSP70表达(1.42±0.21)与ANP组相比较，表达明显上调(P<0.01)，与对照组相比较，表达亦明显上调(P<0.01)。ANP组肺病理评分(3.87±0.83)高于对照组(2.80 ±0.44，P<0.05)，也高于 CQCQD组(3.00±0.63P<0.05)，对照组肺病理评分与CQCQD组相比较，无统计学差异(P>0.05)。结论 CQCQD可明显上调小鼠肺HSP70表达，能明显减轻ANP小鼠肺的损伤。

柴芩承气汤； 急性坏死性胰腺炎； 热休克蛋白

急性胰腺炎(sacute pancreatitis,AP)20%～30%患者临床过程凶险，总体病死率5%～10%[1]。早期常死于全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS) 导致的多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[2.3]，其中肺是最早且最易受累的器官，约1/3重症急性胰腺炎(sever acute pancreatitis,SAP)病人出现急性胰腺炎相关性肺损伤(acute pancreatitis-associated lung injury，APALI)或进一步发展成为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)，APALI/ARDS所造成的死亡病例约占SAP病人第一周死亡病例的60%[4]。近年来的临床实践表明柴芩承气汤(Chai Qin Cheng Qi Decoction，CQCQD)是治疗SAP的有效中药方剂[5。6]，具有通里攻下、破痞除满、清热解毒、凉血活血的功效，可以排除胃肠积滞，清除肠道内的细菌和内毒素，保护肠道的机械和免疫屏障，减少SAP休克的发生率，减缓ARDS、肾功能衰竭、心功能不全、肝功能不全及肠麻痹持续时间，减少手术中转率，缩短SAP病程[7]。但是，CQCQD减轻APALI具体作用机制尚未明确。本实验旨在通过观测ANP小鼠第6h的肺HSP70表达及肺病理评分变化。初步探讨CQCQD减轻小鼠APALI的作用机制及具体作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年昆明小鼠30只，雌雄不拘，体质量20～25g，四川大学华西医学中心实验动物中心提供。许可证号：scxk(川)2009-09。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制作 ①ANP模型的制作：健康昆明小鼠适应性喂养7d，实验前禁食12h，不禁水。采用8%L-精氨酸溶液(L-arginine，美国sigma公司生产，用生理盐水配制而成，PH值为7.0) 腹腔注射制作小鼠ANP模型，每次4.0mg·g-1，1h后重复注射一次，72h后即为造模成功[8]。②假模型的制作：造模前准备健康昆明小鼠适应性喂养7d，实验前禁食12h，不禁水。采用生理盐水代替8%L-精氨酸溶液，注射方法与ANP模型相同。

1.2.2 柴芩承气汤方剂的组成：柴胡15g、黄芩15g、厚朴15g、枳实15g、茵陈蒿15g、栀子20g、生大黄20g(后下)、芒硝20g(冲服) 。柴芩承气汤煎剂制作 峨眉山市人民医院制剂室制作。先将中药用清水浸泡1h，在用煎药机煎1/2h，煎成200ml/剂。

1.2.3 冻干粉的制作：由四川大学基础医学院生化测试中心，-70℃制作成冻干粉[26]。冻干粉制剂的配制：实验前用注射用水按2.4g生药/ml配制备用。主要试剂：热休克蛋白-70抗体，从博奥森生物科技公司购买。

1.2.4 实验方法 给定种子数，以SPSS10.0统计分析软件，将健康30只昆明小鼠随机分成对照组、ANP组、CQCQD组(n=3×10)。对照组：采用假模型小鼠，背部皮下注射生理盐水1ml，1次/2h，生理盐水0.1ml/10g灌胃，1次/2h。于第6h取右肺第2叶肺组织连同部分支气管，分别做病理检查，其余肺组织用于检测HSP70水平。ANP组：采用ANP模型小鼠，背部皮下注射生理盐水1ml，1次/2h，生理盐水0.1ml/10g灌胃，1次/2h。于第6h取右肺第2叶肺组织连同部分支气管，分别做病理检查，其余肺组织用于检测HSP70水平。CQCQD组：采用ANP模型小鼠，背部皮下注射生理盐水1ml，1次/2h，CQCQD制剂0.1ml/10g灌胃，1次/2h。于第6h取右肺第2叶肺组织连同部分支气管，分别做病理检查，其余肺组织用于检测HSP70水平。

1.3 观察指标 小鼠肺HSP70表达及肺病理评分。小鼠肺HSP70检测采用Western免疫印迹(Western Blot)法。结果采用HSP70与内参照β-actin条带的灰度比来表示。肺病理学评分标准参照文献的标准[9]，由同一病理医师单盲在光学显微镜下进行病理评分，每张切片随机取10个高倍视野，每张切片的最后评分为该10视野评分的平均值。

2 结果

2.1 各组肺HSP70表达水平比较 ANP组HSP70表达(0.93±0.03)与对照组(0.81±0.09) 相比较，表达无明显改变(P>0.05)，CQCQD组HSP70表达(1.42±0.21)与ANP组相比较，表达上调(P<0.01)，与对照组相比较，表达亦上调(P<0.01)。 CQCQD组灰度较对照组和ANP组有明显加深、加宽，见图1。

图1 各组肺HSP70 Western Blot 电泳图

Figure 1 Electrophotogram of HSP70 by Western blot

注：A1～A3为对照组， B1～B3为ANP组， C1～C3为CQCQD组

2.2 各组肺病理评分比较 ANP组肺病理评分(3.87±0.83)与对照组(2.80 ±0.44)相比较，有统计学差异(P<0.05)，ANP组肺病理评分与 CQCQD组(3.00±0.63)相比较亦有统计学差异(P<0.05)，对照组肺病理评分与CQCQD组相比较，无统计学差异(P>0.05)。

3 讨论

AP患者20%～30%有临床经过凶险，总体病死率达5%～10%。AP病理生理过程中，胰酶的异常激活导致局部细胞因子的活化，继而由于炎症级联“瀑布效应”使促炎因子大量产生和释放，导致体内促炎因子和抗炎因子失衡，如发生SIRS，大量中性粒细胞、单核-巨噬细胞等炎症细胞向肺部趋化、游走、聚集，释放一系列细胞因子及损伤性炎症介质，导致肺泡上皮、肺微血管内皮和肺间质的急性弥漫性损伤而发生APALI。当细胞受到损伤性刺激时，细胞内热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)表达上调。HSPs具有多种生物学功能，可促进受损细胞的自身修复，对其起到保护作用[10]。其中，HSP70是HSPs家族最主要的成员之一，HSP70可以减轻肺部炎症反应、肺组织细胞凋亡以及肺水肿，改善肺的氧合功能，提高肺组织对各种损伤的耐受性，对肺起到保护作用[11]。

大多数AP在祖国医学六经辨证中属于阳明腑实证。在疾病的发展过程中，因脏腑湿热蕴结、气滞血瘀，导致大肠之气闭塞不通而上逆，肺气被遏，失其宣肃，出现“喘”、“满”症情。中医理论认为“肺与大肠相表里”，大肠气机通畅则肺气才能得以肃降，因此及早“通里攻下”，恢复肠道动力功能 ，能减轻对肺部的损伤，缓解肺部“喘”、“满”症状。近年来的临床实践表明柴芩承气汤是治疗SAP的有效中药方剂[5.6]，其由张仲景《伤寒论》治疗阳明腑实证的经典名方“大承气汤”加柴胡及黄芩组成，具有通里攻下、破痞除满、清热解毒、凉血活血的功效，可以排除胃肠积滞，清除肠道内的细菌和内毒素，保护肠道的机械和免疫屏障，减少SAP休克的发生率，ARDS、肾功能衰竭、心功能不全、肝功能不全及肠麻痹持续时间，减少手术中转率，缩短SAP病程[7]。

本实验发现CQCQD组HSP70表达(1.42±0.21)与ANP组(0.93±0.03)相比较，表达上调(P<0.01)，而CQCQD组肺病理评分(3.00±0.63)低于ANP组 (3.87±0.83，P<0.05)，提示CQCQD能上调肺HSP70表达并减轻ANP小鼠肺的损伤。

4 结论

本文研究结果提示，CQCQD可上调小鼠肺HSP70表达，能明显减轻ANP小鼠肺的损伤，对临床研究具有启迪意义，但其作用机制尚需进一步研究。

[1]中国急性胰腺炎诊治指南(2013年，上海) [J].胃肠病学, 2013，18(7)：428-433.

[2]杜微，王红，张淑文，等.全身炎性反应综合征与急性胰腺炎病情严重程度关系的探讨[J].中国危重病急救医学,2005，17(5)：279-281.

[3]Nathens, Avery B, Curtis,etal. Management of the critically ill patient with severe acute pancreatitis[J].Critical Care Medicine. 2005，32 (12): 2524-2536.

[4]Surbatovic M , Jovanovic K , Radakovic S ,etal. Pathophysiological aspects of severe acute pancreatitis-associated lung injury[J]. Srp Arh Celok Lek,2005，133(1-2): 76-81.

[5]刘续宝，蒋俊明，黄宗文，等.中西医结合治疗重症急性胰腺炎的临床研究(附1376例报告) [J].四川大学学报(医学版) ，2004，(2)：204-208.

[6]薛平，黄宗文，张鸿彦，等.柴芩承气汤对重症急性胰腺炎大鼠胆碱能抗炎通路的影响[J].四川大学学报(医学版)，2006，37(1)：66-68.

[7]王忠朝，薛平，黄宗文,等.早期应用柴芩承气汤治疗重症急性胰腺炎并发急性呼吸窘迫综合征的临床观察[J].中国中西医结合杂志，2009，29(4)：322-324.

[8]Paszt A, Eder K, Szabolcs A,etal. Effects of glucocorticoid agonist and antagonist on the pathogenesis of L-arginine-induced acute pancreatitis in rat[J]. Pancreas，2008,36(4):369-376.

[9]Osman MO,Jacobsen NO,Jacobsen NO．A monoclonal anti-interleukin 8 antibody(WS-4)inhibits cytokine response and acute lung injury in experimental severe actue necrotising pancreatitis in rabbits [J].Gut,1998，4(2):232-239.

[10] 刘敬臣，曾邦雄.热休克蛋白对急性肺损伤的保护作用[J].国外医学(麻醉学与复苏分册),2002，23(6)：363-366.

[11] 杨灿，吴伟力，靳妍，等.热休克蛋白-70对急性肺损伤的保护作用[J].中外医疗,2009，28(24)：177-178.

Effect of Chaiqinchengqi Decoction on expression of lung heat shock protein 70 and lung pathological changes in acute necrotizing pancreatitis mice

CHENG Zhengyu, WANG Minghua, LUO rong,etal

(DepartmentofGastroenterology,ThePeople'sHospitalofEmeishan,Emeishan614200,Sichuan,China)

Objective To investigate Chaiqinchengqi decoction (CQCQD) on expression of lung heat shock protein 70 and lung pathological changes in acute necrotizing pancreatitis(ANP) mice. Methods 30 mice were randomized into control group ANP group and CQCQD group with 10 mice in each group. L-arginine was administered intraperitoneally twice at doses of 4g/kg at intervals of 1 hour to induce the ANP of rats. All the rats in the CQCQD group were administrated the CQCQD at doses of 0.1 ml/10g at intervals of 2 hours. The expression of lung heat shock protein 70 and lung pathological changes were observed.Results The expression of lung HSP70 in CQCQD group was 1.42±0.21 (HSP70/β-actin) while that in the control group and ANP group were 0.81±0.09 (HSP70/β-actin) and 0.93±0.03 (HSP70/β-actin), respectively. The changes of expression of lung HSP70 in CQCQD group was more obvious than that in the ANP group and control group (both,P<0.01). However, there was no significant difference between the ANP group and control group (P>0.05). The pulmonary pathological score in ANP group was 3.87±0.83 while that in the control group and CQCQD group were 2.80±0.44 and 3.00±0.63, respectively. The pulmonary pathological score in ANP group was higher than that in the control group and CQCQD group (both,P<0.05). However, there was no significant difference between the control group and CQCQD group (P>0.05).Conclusion The findings of the study indicate that CQCQD can elevate the expression of lung heat shock protein 70 and reduce the damage of ANP mice lung.

Chaiqinchengqi Decoction; Acute necrotizing pancreatitis; Heat shock protein 70

四川省科技支撑计划项目(2014SZ0211)

R 576

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.07.008

2014-11-21; 编辑： 陈舟贵)