干扰paralemmin-3表达抑制脂多糖诱导的肺泡上皮细胞的炎性反应*

陈旭昕 孟激光 韩志海 刘振千 李泳群 张燕 段蕴铀

(中国人民解放军海军总医院呼吸内科，北京 100037)

干扰paralemmin-3表达抑制脂多糖诱导的肺泡上皮细胞的炎性反应*

陈旭昕 孟激光 韩志海 刘振千 李泳群 张燕 段蕴铀

(中国人民解放军海军总医院呼吸内科，北京 100037)

目的 探讨干扰paralemmin-3(PALM3)表达对脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮A549细胞炎性反应的影响。方法 实验分为正常细胞组(未转染)、对照转染组(转染control siRNA)及PALM3 siRNA转染组(转染针对PALM3的小干扰核糖核苷酸siRNA)三组；采用Western-blot法测PALM3 蛋白表达水平，检验PALM3 siRNA的干扰效率。三组细胞同时给予LPS刺激12 h后，收集细胞培养上清液和总蛋白， ELISA法检测各组细胞培养上清中的TNF-α、IL-1β含量，同时用Western-blot法检测各组细胞中单免疫球蛋白白介素-1受体相关蛋白(SIGIRR)表达水平。结果 特异性siRNA转染后成功干扰了PALM3在A549细胞中的表达；给予LPS刺激后，与正常细胞组及对照转染组相比，PALM3 siRNA转染组细胞培养上清中TNF-α、IL-1β水平显著下降，同时PALM3 siRNA转染组细胞中SIGIRR的表达上调。结论 干扰PALM3的表达可减轻A549细胞对LPS诱导的炎性反应，其可能机制是通过上调Toll样受体/白介素-1受体(TIR)负调控分子SIGIRR的表达来实现的。

paralemmin-3； 脂多糖； 肺泡上皮细胞； RNA干涉； 炎症

Paralemmin-3 (PALM3)于1992年由Cornish等首次在非洲爪蛙 (Xenopus laevis)中发现，被称为Xlgv7/Xlcaax-1，属于Paralemmin蛋白家族[1]。研究发现，PALM3可能与膜蛋白的运输或靶向有关，可能作为“接头”分子参与信号转导[2]。同时有研究表明，PALM3在脂多糖 (lipopolysacharride, LPS)刺激后其表达呈上调趋势，这一表达模式则类似于接头分子MyD88、TRIF及病原模式受体TLR4[3]，提示PALM3亦可能是Toll样受体/白介素-1受体(Toll like receptor/Interleukin-1 receptor, TIR)信号通路中的关键分子。因此从上述理论推断干扰PALM3表达，应能减轻LPS诱导的炎性反应。鉴于此，本实验拟以小干扰核糖核苷酸(small interfering RNA, siRNA)为介导，干扰PALM3在人肺泡上皮细胞系A549细胞中的表达，观察PALM3表达下调后对LPS诱导的A549细胞炎性反应的影响，同时对可能的分子机制进行探讨，以期为炎性调控提供更多实验室依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂 A549细胞购自中国科学院上海细胞所。Control siRNA和PALM3 siRNA均购置美国Santacruz公司。Lipofectamine 2000和Opt-MEM 无血清培养基购自美国Invitrogen 公司，LPS(Ecoil0111：B4)购自美国Sigma，高糖RPMI1640培养基和胎牛血清(FBS)均为BIBCO公司产品。人TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒购自深圳达科为生物技术公司。抗人PALM3抗体为Novus Biologicals公司产品。抗人SIGIRR抗体及PVDF膜购自美国SantaCruz公司。相对应二抗、抗人GAPDH 抗体、增强型ECL发光试剂盒、蛋白定量BCA 法试剂盒和细胞总蛋白提取试剂盒均为碧云天生物技术公司产品。其他生化试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 在37.0℃、5% CO2及95%湿度条件下，将A549细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中，隔天换液1次，2～3 d传代1次。实验用细胞均处于对数生长期。质粒转染前1 d以3×105/孔接种至24孔板中，待细胞融合为70%时用于实验。按照Santa Cruz公司的说明书，分别稀释control siRNA和PALM3 siRNA，然后按照invitrogen公司Lipofectamin2000试剂说明操作，用50 μL Opti-MEM减血清培养基分别稀释20 pmoL siRNA及1μL Lipofectamin2000然后再将两者混匀，室温孵育20min；将上述混合液加入到24孔板的一个孔中，在37℃，5%CO2及95%湿度条件下，培养6 h；更换成含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基继续培养48 h，备用后续实验。

1.2.2 PALM3蛋白表达水平检测 按上述方法接种转染细胞，共分为正常细胞组、对照转染组(转染control siRNA)和PALM3 siRNA转染组。转染48 h后，用Western blot法检测PALM3蛋白水平。分别收集各组细胞，用PBS洗涤1次，加入碧云天细胞总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，并按蛋白定量BCA 法试剂盒说明书进行蛋白浓度测定，取总蛋白相等的样品行SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜上，转膜结束后，将PVDF膜取出用5%脱脂奶粉37℃封闭2 h，与一抗4℃ 孵育过夜，洗膜3次后与辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育2 h，同前洗膜3次后，用增强型ECL发光试剂盒显影，曝光显影扫描后，用LeicaQwin图像分析软件进行吸光度积分值分析。

1.2.3 细胞培养上清TNF-α、IL-1β含量检测 接种及转染细胞操作同前，三组转染 48 h后，加入10 μg/ml的LPS刺激12h后，终止培养收集三组细胞培养上清，用达科为ELISA试剂盒分别检测TNF-α、IL-1β含量，具体操作参照说明书进行。每个样本设置3个复孔，检测结果取平均值。

1.2.4 SIGIRR蛋白表达水平检测 接种及转染细胞操作同前，三组转染48 h后，弃去原培养液，PBS轻轻洗涤细胞1次后，加入10 μg/ml的LPS刺激12h后终止培养，收集各组细胞，同前操作行Western blot检测，检测各组细胞中SIGIRR蛋白表达水平。

2 结果

2.1 PALM3蛋白表达水平 与正常细胞组及对照转染组相比，PALM3 siRNA转染组PALM3条带的光密度积分值低于前两组，提示转染PALM3 siRNA后PALM3蛋白表达水平显著下降，表达被下调，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 各组PALM3蛋白表达水平检测

Figure 1 The PALM3 protein expression levels in different groups

注：与正常细胞组及对照转染组比较，①P<0.05。

2.2 细胞培养上清中TNF-α、IL-1β含量 用ELISA法检测LPS刺激12h后各组细胞培养上清中TNF-α、IL-1β含量。结果显示，与正常细胞组及对照转染组相比，PALM3 siRNA转染组培养上清中炎性因子TNF-α、IL-1β含量均显著下降(P<0.05)，见图2。

图2 LPS刺激后各组细胞培养上清中TNF-α、IL-1β的含量

Figure 2 The levels of TNF-α and IL-1β in the culture supernatants of different groups after LPS-stimulation

注：与正常细胞组及control siRNA转染组比较，①P<0.05

2.3 SIGIRR蛋白表达水平 Western blot结果显示，与正常细胞组及对照转染组相比，PALM3 siRNA转染组SIGIRR条带的光密度积分值显著高于前两组，提示给予LPS刺激后在PALM3 siRNA转染组A549细胞中SIGIRR蛋白水平较前两组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 LPS刺激后各组SIGIRR蛋白表达水平检测

Figure 3 The SIGIRR protein expression levels in different groups after LPS-stimulation

注：与正常细胞组及对照转染组比较，①P<0.05。

3 讨论

炎症失控是ALI/ARDS、急性胰腺炎及炎性肠病等众多疾病的关键机制，调控炎症瀑布反应，避免有害和不适宜的炎症反应是治疗ALI/ARDS等炎性疾病的重要策略[4]。Toll样受体/白介素-1受体(Toll like receptor/Interleukin-1 receptor, TIR)信号通路过度激活是导致炎症反应爆发的主要机制之一[5]。下调此信号通路中“接头分子”的表达水平，可抑制TIR信号通路过度激活，从而减轻炎性反应并改善ALI/ARDS患者预后。肺泡上皮细胞是ALI/ARDS的发生发展重要的靶细胞之一，因此本研究利用RNA干扰技术下调人肺泡上皮细胞系(A549细胞)中PALM3的表达，研究结果证实下调PALM3表达减轻了LPS诱导的炎性反应。

PALM3属于Paralemmin蛋白家族。 Paralemmin蛋白家族可能与细胞质膜动力学有关[6～9]。目前对于PALM3的确切功能尚不清楚，有报道显示，PALM3可能与膜蛋白的运输或靶向有关，如可作为接头连接内在的膜蛋白分子[2]。PALM3的表达具有细胞特异性，我们前期研究发现PALM3在人肺泡上皮细胞系(A549细胞)中亦有较高丰度的表达，且LPS刺激后PALM3与MyD88、TRIF及病原模式受体TLR4等TIR信号通路中的信号分子存在类似表达模式[3]。因此推测PALM3亦可能是TIR信号通路中的接头分子或信号转导的关键分子。本研究利用RNA干涉技术下调了A549细胞中PALM3的表达。经过LPS刺激后，PALM3表达下调组细胞释放炎性因子显著减少，提示干扰A549细胞中PALM3表达可以减轻LPS诱导的炎性反应。

单免疫球蛋白白介素-1受体相关蛋白(single immunoglobin IL 1 receptor related protein，SIGIRR)是Toll样受体/白介素一1受体(Toll like receptor/Interleukin-1，TLR/IL-1)超家族成员之一，属于TLR/IL-1信号通路中的负性调控分子[10]。有报道上调SIGIRR可抑制核转录因子的转录活性，减轻内毒素(lipopolysacharride, LPS)诱导的炎症反应[5]。可能的机制是以配体依赖的方式分别与IL-1R或TLR4受体复合物结合，阻碍信号转导从而抑制炎症反应[11]。

4 结论

本研究结果显示，下调PALM3的表达后再给予LPS刺激，SIGIRR在A549细胞中的表达水平较正常细胞组及对照转染组显著升高，提示下调PALM3表达而抑制LPS诱导的炎性反应，可能是通过上调负调控分子SIGIRR的表达来实现的。目前已有研究显示，PALM3与SIGIRR之间存在相互作用，但PALM3与SIGIRR之间存在怎样的“交联”对话以及具体的分子调控机制尚不清楚，仍需进一步深入研究。

[1]Cornish JA, Kloc M, Decker GL,etal. Xlcaax-1 is localized tothe basolateral membrane of kidney tubule and other polarized epithelia during xenopus development [J]. Dev Biol, 1992, 150(1): 108-20.

[2]Hu B, Petrasch-Parwez E, Laue MM,etal. Molecular characterization and immunohistochemical localization of palmdelphin, a cytosolic isoform of the paralemmin protein family implicated in membrane dynamics [J]. Eur J Cell Biol, 2005, 84(11): 853-866.

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[5]Chen X，Zhao Y, Wu X,etal. Enhanced expression of single immunoglobulin IL-1 recepter-related molecule ameliorates Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice [J]. Shock, 2011, 35(2): 198-204.

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[11] Qin JZ, Qian YC, Yao JH,etal. SIGIRR Inhibits Inerleukin-1 Receptor and Toll-like receptor4-mediated Signaling through Different Mechanisms [J]. J Bio Chem, 2005, 280(26): 25233-25241.

Downregulation of PALM3 expression inhibits the inflammatory reaction induced by LPS in alveolar epithelial cells

CHEN Xuxin,Meng Jiguang，HAN Zhihan，etal

(DepartmentofRespiratory,NavyGeneralHospitalofPLA,Beijing100037,China)

Objective To explore the effect of downregulation of paralemmin-3 (PALM3) expression on the LPS-induced inflammatory reaction in alveolar epithelial cells(A549 cells). Methods The A549 cells were divided into three groups (PALM3 siRNA group, control group and normal group). In PALM3 siRNA group, the expression of PALM3 was down-regulated by PALM3 siRNA in A549 cells; in control group, the cells were transfected with the control siRNA and any intervention was not administered in normal group. At 48h after transfection, the protein expression levels of PALM3 in A549 cells were determined by Western-blot analysis. LPS was given to the cell culture medium after transfection. The culture supernatant and cellular total protein were collected at 12 h after LPS-stimulation. The levels of TNF-α and IL-1β were detected by ELISA. The protein expression levels of SIGIRR were also measured by Western-blot analysis. Results The expression of PALM3 was successfully suppressed by PALM3 siRNA. Compared with control and normal groups, downregulation of PALM3 expression could significantly decrease the release of TNF-α and IL-1β in A549 cells after LPS-stimulation. And, the protein levels of SIGIRR were significantly upregulated after LPS-stimulaition in PALM3 siRNA group. Conclusion Downregulation of PALM3 expression could attenuate the LPS-induced inflammation in alveolar epithelial cells. Upregulation of SIGIRR protein expression may be one of the possible mechanisms.

Paralemmin-3； Lipopolysacharride; Alveolar epithelial cell; Small interfering RNA; Inflammation

国家自然科学基金(81300050)；海军总医院创新培养基金(CXPY201417)

韩志海，医学博士，硕士生导师，E-mail：hzhngh@sina.com

R 563.9

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.07.002

2014-11-17； 编辑： 陈舟贵)