结核分枝杆菌T7噬菌体展示基因组DNA文库的构建与鉴定

曾焱华,王 丽，刘海灿，游晓拢，邓湘赢，万康林

结核分枝杆菌T7噬菌体展示基因组DNA文库的构建与鉴定

曾焱华1,王 丽1，刘海灿2，游晓拢1，邓湘赢1，万康林2

目的 利用T7噬菌体作为载体，构建结核分枝杆菌的基因组DNA文库。方法 提取MTB的基因组DNA，用EcoR I和Hind III进行双酶切，以对基因组DNA进行片段化，并在其末端加上定向的EcoR I和Hind III黏性末端，用DNA片段纯化分离柱除去小于200 bp的片段和多余接头。将DNA片段与T7 10-3b噬菌体连接，经包装蛋白进行包装后转入BLT5403宿主菌以构建T7噬菌体展示基因组DNA文库，并检测文库的滴度和随机性。结果 成功提取到较高质量的MTB基因组DNA；构建的T7噬菌体展示基因组DNA文库的滴度约为6×106pfu/cm3；用PCR检测结果表明，在随机挑取的16个噬菌斑中，其重组率为100%，且插入片段都介于250～2 000 bp左右。结论 成功构建了MTB T7噬菌体展示基因组DNA文库，为从基因组范围筛选MTB的优势抗原奠定了前期实验基础。

结核分枝杆菌；基因组DNA；T7噬菌体展示文库

Supported by the Major Project of National Science and Technology(No. 2013ZX10003006-002) and the Hunan Provincial Cooperative Innovation Center for Molecular Target New Drug Study(No.2014-405) Corresponding authors: Wan Kang-lin, Email: wankanglin@icdc.cn

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)是1882年由德国科学家Robert Koch首次分离培养出来的一种病原体，由其引起的结核病(Tuberculosis，TB)是一种人兽共患慢性传染病[1]。在2012年召开的Euroscion结核病峰会上，Maitra A报道2012年全球约有新发TB患者860万病例，其中130万例死于TB[2]。因此，TB成为全球公共卫生安全的重大威胁，是传染病中仅次于艾滋病的第二大杀手。卡介苗(Bacillus almette-Guerin，BCG)是目前唯一可用于人群免疫的TB疫苗，但其保护效果不太明显(保护率为0%～80%)，且具有明显的地区性差异[3]，因此，研究新型、安全、有效的TB疫苗迫在眉睫。

噬菌体展示技术(Phage display technology)通过将编码外源目的多肽或蛋白的DNA序列插入到噬菌体特定的衣壳蛋白基因中，使目的多肽或蛋白与噬菌体衣壳蛋白以融合蛋白形式呈现在噬菌体表面，经表型筛选即可获得编码外源目的多肽或蛋白的DNA序列[4]。基于噬菌体展示技术发展起来的噬菌体展示基因组DNA文库具有高通量淘选、易于纯化等诸多优点，已被广泛应用于优势抗原或表位筛选、蛋白质-蛋白质相互作用和配体-受体研究等领域[5]。

本研究拟提取MTB的基因组DNA，利用T7噬菌体做为载体，构建成MTB的基因组DNA文库，并对文库的库容和重组率等进行检测，以便为从全基因组范围筛选MTB的免疫优势抗原，丰富TB的诊断与疫苗候选抗原奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料 T7 Select system试剂盒、EcoRI/Hind III接头(5′-GCTTGAA TTCAAGC-3′)、T7筛选前引物(T7 Select UP Primer：5′-GGAGCTGTCGTA TTCCAGTC-3′)和T7 筛选后引物(T7 Select DOWN Primer：5′-AACCCCTCAA GACCCGTTTA-3′)均为美国Novagen公司产品；DNA片段纯化分离柱为美国Biomiga公司产品。

1.2 MTB基因组DNA的提取 采用CTAB(溴代十六烷基三甲胺)法提取结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA(由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所国家结核病参比实验室完成)，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，再用核酸蛋白测定仪(DU640，美国Backman公司)检测其OD260与OD280的比值。

1.3 基因组DNA的片段化与末端处理 将T4多聚核苷酸激酶磷酸化的EcoR I/Hind III接头用T4 DNA连接酶连接在基因组DNA的两端,再用EcoR I和Hind III进行双酶切以使基因组DNA片段化，用DNA片段纯化分离柱去除酶切产物中小于200 bp的片段和多余接头。

1.4 T7载体连接与体外包装 将大于200 bp的MTB基因组DNA片段用T4连接酶与T7 10-3b 载体臂于16 ℃连接过夜，将5 μL连接产物加入到25 μL T7 Select Packaging Extract包装蛋白中，于22 ℃孵育2 h以进行噬菌体的体外包装，加入LB 培养基终止包装反应。

1.5 宿主转染 将包装产物与培养到对数生长期(OD600=0.6～1.0)的宿主菌BLT5403充分混合，加入事先预温到50 ℃左右的顶层琼脂(含0.5%酵母提取物、0.5%NaCl、1%胰蛋白胨和0.6%琼脂)并迅速混匀，将其倒入到LB固体培养基(含0.5%酵母提取物、0.5%NaCl、1%胰蛋白胨和1.5%琼脂)中，适当倾斜使其铺平，凝固后置于37 ℃培养箱培养3～4 h。向平皿中加入10 mL抽提缓冲液(100 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，6 mmoL/L MgSO4，pH8.0)于4 ℃孵育过夜。将培养产物与抽提缓冲液反复振荡、吹吸后转入离心管，加入氯仿(每10 mL抽提缓冲液中加入0. 5 mL氯仿)重悬，10 000 r/min 离心5 min，收集上清即为构建好的MTB基因组DNA文库，按1/ 10体积向其中加入80%灭菌甘油，-80 ℃冰箱保存备用。

1.6 文库的滴度测定 取10 μL构建好的T7噬菌体展示MTB基因组DNA文库，用Tris缓冲液(TBS)进行10～105梯度稀释，分别取10 μL不同稀释度的噬菌体文库加入到BLT5403培养物(OD600=1.10)中并充分混合，将其迅速铺于LB固体培养基中，铺平并凝固后置于37 ℃培养3～4 h，计数噬菌斑并计算出文库滴度。

1.7 文库的重组率与随机性检测 从用于滴度测定的平板上随机挑取16个单个噬菌斑于灭菌Ep管内，向管内加入适量的 EDTA缓冲液(10 mmol/L，pH=8.0)，旋涡振荡30 s，置于65 ℃水浴箱孵育10 min，冷却后4 ℃离心3 min(12 000 r/min)以去除沉淀，上清液即为噬菌体裂解液。以2.0 μL噬菌体裂解液为模板，用试剂盒提供的T7 Select引物进行PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

2 结 果

2.1 MTB基因组DNA的提取与检测 对提取的MTB基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，如图1所示，在靠近加样孔处出现的清晰条带为MTB的基因组DNA，图中还出现了一些弥散条带，这可能是由于在DNA提取和运输过程中导致基因组DNA断裂所致，但由于构建文库时需要将基因组DNA片段化，因此这并不影响后续文库的构建。用核酸蛋白测定仪检测基因组DNA的OD260/OD280，结果其比值为1.92，说明提取的DNA质量较好，可用于文库构建。

M: DNA Marker; 1: Genomic DNA; 2: Blank control.

图1 MTB基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳

Fig.1Agarose gel electrophoresis of genomic DNA ofMycobacteriumtuberculosis

2.2 MTB基因组DNA的片段化 利用EcoR I和Hind III对MTB基因组DNA进行双酶切后用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，如图2所示：基因组DNA经片段化后主要显示为弥散的条带。

M: DL 5 000 Marker; 1: Fragments of MTB genomic DNA.

图2 MTB基因组DNA的片段化

Fig.2 Fragmentation of genomic DNA ofMycobacteriumtuberculosis

2.3 MTB基因组DNA片段的分离纯化 用DNA片段纯化分离柱去除小于200 bp的短片段和短的接头，从经片段化的MTB基因组DNA中分离纯化出大于200 bp的DNA片段，用于T7噬菌体展示基因组DNA文库的构建。如图3所示，经片段化分离后，主要保留了约250～4 000 bp之间的DNA片段。

M: DL 5 000 Marker; 1: Isolated and purified fragments of genomic DNA; 2: Blank control.

图3 MTB基因组DNA的片段分离与纯化

Fig.3 Isolation and purification of genomic DNA ofMycobacteriumtuberculosis

2.4 MTB基因组DNA文库具有较高的库容 按照T7 Select system试剂盒说明书成功构建T7噬菌体展示MTB基因组DNA文库后，将文库进行扩增并测定其滴度，结果表明其滴度为6.0×106pfu/cm3，说明文库具有较高的库容，可用于后续筛选。

2.5 MTB基因组DNA文库具有较好的重组率与随机性 以随机挑取的16个噬菌斑为模板，用PCR鉴定文库的重组率与随机性。如图4所示，随机挑取的16个噬菌斑PCR扩增全部成功，说明文库具有很高的重组率；从图可知，插入到噬菌体的外源DNA片段都介于250～2 000 bp范围内，具有较好的随机性。其中7号和16号噬菌斑出现2条条带，说明该序列中含有T7 Select引物的非特异结合位点。将PCR产物测序后进行Blast分析，结果显示这些插入序列均源自MTB的基因组DNA。

M: DL5 000 DNA Marker; 1-16: PCR products.

图4 MTB基因组DNA文库随机克隆的PCR产物琼脂糖凝胶电泳

Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR products of random clones of MTB genomic DNA library

3 讨 论

据估计，全球约有1/3的人口感染过MTB，其中5%～10%将发展成为活动性TB。耐药菌株的出现与扩散、合并感染人类免疫缺陷病毒(HIV)、营养不良、经常吸烟或罹患糖尿病等使免疫系统受损等因素使处于潜伏期的MTB活化或使部分个体继发感染，导致TB的防治形势越来越严峻[6-7]。控制和预防TB已成为全球的公共卫生问题。目前，注射BCG是TB的唯一预防措施，由于BCG的免疫效果不稳定，且只对预防原发性TB有效，对已感染MTB的患者无保护作用。研究人员一直在试图研制一些新型、安全、有效的TB疫苗[8]，但至今没有一种可真正用于临床。因此，发展新型、安全、有效的TB疫苗，以有效控制TB的蔓延迫在眉睫。

如何确定MTB的哪些抗原是能够刺激机体产生特异性免疫反应的优势抗原是研究TB疫苗最关键的问题。随着分子生物学和生物信息学的快速发展，涌现了很多用于病原体抗原筛选的方法，如噬菌体展示基因组DNA文库技术、蛋白质组学、表面分析技术和遗传疫苗学等。这些方法中，由于展示在噬菌体表面的蛋白与天然蛋白相比结构与功能能保持相同或相似，因此基于噬菌体展示技术发展起来的噬菌体展示文库技术在优势抗原或表位的筛选、蛋白质-蛋白质相互作用和配体-受体研究等领域具有巨大的优越性[5]。如Zhao Y等对利用噬菌体展示文库技术获得了具有潜在临床意义的自身免疫性疾病拮抗剂——B细胞刺激因子多肽[9]；Tang B等利用噬菌体展示肽库技术筛选到肠道血管活性肽受体1的特异结合配体[10]。有研究人员利用噬菌体展示肽库技术筛选到生殖支原体粘附素蛋白MgPa的抗原表位[11]和MgPa的受体多肽[12]。

最常用于噬菌体展示的载体有M13丝状噬菌体和T7噬菌体，其中T7噬菌体在文库构建方面具有明显的优越性：1)T7噬菌体可展示多达1 200个氨基酸的蛋白或多肽，而M13噬菌体仅能展示小于30个氨基酸的蛋白或多肽；2)T7噬菌体是裂解性噬菌体，其展示的蛋白不需分泌，因而能使更多的序列可能被展示；3)T7繁殖速度比M13快，更能节省时间；4)T7噬菌体活性强、稳定性高。

本研究中，我们将MTB的基因组DNA片段克隆入T7Select10-3b载体，经包装后构建成T7噬菌体展示MTB基因组DNA文库。经检测文库滴度为6.0×106pfu/cm3；用PCR鉴定随机挑取的噬菌斑，结果文库的重组率达到100%，且插入片段都介于250～2 000 bp。这些结果表明：成功构建了T7噬菌体展示MTB的基因组DNA文库。在下一步的研究中，将以纯化的结核病人血清为靶分子，对构建的T7噬菌体展示MTB基因组DNA文库进行亲和筛选，以期从全基因组范围内获得MTB的免疫优势抗原，并研究这些抗原在结核病的诊断制剂与疫苗研制中的应用价值，以丰富结核病的诊断与疫苗候选抗原。

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Construction and identification of T7 phage display genome DNA library ofMycobacteriumtuberculosis

ZENG Yan-hua1,WANG Li1,LIU Hai-can2,YOU Xiao-long1,DENG Xiang-ying1,WAN Kang-lin2

(1.InstituteofPathogenicBiology,UniversityofSouthChina,HunanProvincialKeyLaboratoryforSpecialPathogensPreventionandControl,Hengyang421001,China; 2.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl/NationalInstituteforcommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

T7 phage displayed library of genomic DNA ofMycobacteriumtuberculosiswas constructed to further screen the immunodominant antigens from the whole genome ofMycobacteriumtuberculosis. The total genomic DNA ofMycobacteriumtuberculosiswas extracted and digested withEcoRI andHindIII in order to fragment the genomic DNA and ligated withEcoRI /HindIII sticky ends. The DNA fragments that were longer than 200 bp were collected and ligated into the T7 10-3b phage vector. After packagedinvitro, the recombinant T7 phage vectors were transformed into BLT5403 to construct the T7 phage display library. The genomic DNA with high quality was successfully extracted. The titer of T7 phage display library was about 6×106pfu/cm3. The 16 phage plaques were randomly selected and amplified by PCR. The results of PCR showed that the recombination ratio was about 100%, and the inserts were long between 250 bp and 2 000 bp. And the results of BLAST analysis showed all sequences are originated fromMycobacteriumtuberculosis. These results indicated that the T7 phage display genome DNA library ofMycobacteriumtuberculosiswas successfully constructed, which lay the foundation for the screening of the immunodominant antigens from the whole genome ofMycobacteriumtuberculosis.

Mycobacteriumtuberculosis; genomic DNA; T7 phage display library

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.007

国家科技重大专项课题(No.2013ZX10003006-002)和湖南省分子靶标新药研究协同创新中心(湘教通2014-405号)联合资助

万康林，Email: wankanglin@icdc.cn

1.南华大学病原生物学研究所，“特殊病原体防控”湖南省重点实验室，衡阳 421001； 2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206

R378.91

A

1002-2694(2015)12-1120-04

2015-07-23；

2015-19-07