抗痛蝎毒素多肽的重组表达研究

冉秋行，刘 霞，杨清湖，白占涛

(延安大学生命科学学院/多肽资源药物研究中心；陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西延安716000)

抗痛蝎毒素多肽的重组表达研究

冉秋行，刘 霞，杨清湖，白占涛*

(延安大学生命科学学院/多肽资源药物研究中心；陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西延安716000)

蝎毒素多肽作用于众多细胞膜离子通道，调控通道动力学特性。显具抗痛活性的蝎毒素多肽呈现较高的学术研究价值和医药应用前景。序列比对分析发现，抗痛蝎毒素多肽具较高保守型，序列同源性达45%，均具8个半胱氨酸残基，且其位置相对保守，这可能与抗痛功能有关。天然蝎毒素蛋白的获得、结构与功能研究受限，而高纯度、高活性重组毒素多肽是一条有效解决途径。本文综述抗痛蝎毒素多肽的重组表达，藉此推进其结构与功能相关性的理解。

蝎毒素多肽；抗痛；序列比对；重组表达

蝎子作为五毒之一，在地球上分布广泛，蝎毒素的多态性致使功能的多样性，是各国科学家研究的焦点。蝎蜇诱发的高死亡率已引起医学界高度关注，已然成为威胁人类健康重要问题。传统中医使用全蝎治疗关节炎、风湿痛等病症，这种致痛与抗痛的矛盾统一体具极高的学术和应用价值。蝎毒素多肽是一类生物活性物质，由28-76个氨基酸残基组成，根据其肽链的长短，可分为蝎长肽链毒素和蝎短肽毒素[1]。根据其作用的细胞膜离子通道的不同可分为Na+通道毒素、K+通道毒素、Cl-通道毒素和Ca2+通道毒素[2，3]。此外，根据蝎毒素疼痛效应的不同又可分为致痛蝎毒素和抗痛蝎毒素。现已发现蝎毒多肽具有抗肿瘤、中枢镇痛、抗血栓以及抗虫作用，其作用机理一直是生物医学研究热点。

本文对抗痛蝎毒素多肽进行序列比对分析，并总结相关抗痛蝎毒素多肽重组表达体系，旨在为体外获得高质量抗痛蝎毒素多肽，为进一步阐明抗痛蝎毒素多肽作用机理奠定基础。

1 抗痛蝎毒素多肽及序列分析比对

抗痛蝎毒素-β蝎毒素靶向结合在电压门控钠通道第四个位点上，其通过电压传感器俘获机制特异性调节电压依赖性钠通道激活，使钠电流向复极化方向移动，这可能是其镇痛机理[4]。研究发现BmK IT2、BmK IT-AP、BmK I1、BmK I4、BmK I6 、BmK dITAP3 、BmK AS、BmK AS-1、BmK Ang P1、BmK AGAP、BmK Ang M1、BmKAGP-SYPU1、BmK-YA、BmK9等多种蝎毒素多肽均具镇痛效应[5，6]。如，BmK IT2可显著抑制福尔马林和角叉菜胶等炎症致痛效应[7]，同时，发现BmK IT2作用于钠通道，易化钠通道的稳态激活，使钠通道稳态失活曲线向超极化方向移动[8]，失活钠通道增加可能是其镇痛机制。Cao等报道BmKAngM1具镇痛活性，其机制可能是通过抑制电压依赖Na+电流和延迟电压依赖内向整流K+电流[9]。生理状态下BmKAS和BmKAS-1可显著抑制大鼠热痛觉过敏，炎症状态下这种抑制则更为明显。同时电生理记录发现BmKAS和BmKAS-1可显著抑制TTX-R和TTX-S钠电流[8，10]，这可能是其抗痛觉过敏原因所在。研究发现BmK AGAP-SYPU2是一种类α型蝎毒素，有类似吗啡药镇痛活性[11]。BmK-YA属酰胺类化合物，含有一段脑啡肽类似序列，脑啡肽具有镇痛功效，BmK-YA可以激活哺乳动物阿片受体，为研究G-蛋白偶联受体提供依据[12]。东亚钳蝎毒素BmK9，定点诱变54位丝氨酸或替换此位氨基酸，发现该多肽抗痛活性丧失，表明54位丝氨酸在BmK9毒素抗痛活性中扮演重要角色，可能是通过侧链氢键起作用的[13]。

抗痛蝎毒素多肽氨基酸残基数目差异较大。氨基酸序列比对发现，这些毒素多肽间同源性较高。对BmKAS、BmKAS、BmKAGAP-SYPU1、BmKAGAP-SYPU2、BmK9、BmK-TX11P、BmK-TX10P、BmαTX14等抗痛毒素做蛋白序列分析，发现其同源一致性达45%，同源序列位置相对保守，主要集中在碳端，且均具8个半胱氨酸残基，这极有可能跟它们的抗痛功能有关(图1)。α毒素序列略长于β毒素，α型作用于哺乳动物，我们称之为哺乳类抗痛蝎毒素，而β型作用于昆虫，称之为昆虫抗痛蝎毒素。对哺乳类抗痛蝎毒素BmK9、BmK-TX11P、BmK-TX10P、BmαTX14、BmKαIV、BmKAGAP等进行序列比对，发现它们的5’端氨基酸序列一致性很高，并且哺乳类抗痛毒素多肽含酸性氨基酸(如天冬氨酸，谷氨酸)的数目较昆虫类抗痛毒素的多。而碱性氨基酸所含数目哺乳类与昆虫类大体无异，并且在相同氨基酸位置上哺乳类抗痛毒素多为精氨酸，而昆虫类抗痛毒素多是赖氨酸。这些抗痛类毒素都有一个显著特征，在它们相同位置上都存在半胱氨酸，甘氨酸和脯氨酸。

昆虫抗痛毒素BmKAS、BmKAS、BmKASs、AaHIT4、BmK-IT2、BmK-ITa、BmK-ITb、LqhIT2、BmKI1、BmKI4、BmKAngP1、BmKAngM1序列较哺乳类的长，脯氨酸多存在于昆虫抗痛毒素较哺乳动物序列长出来的部分，这种分布可能在维持它们的结构和抗痛功能上极为关键。BmKAGAP-SYPU1、BmKAGAP-SYPU2较BmKAGAP5’端氨基酸数目少，但是它们的抗痛效应却是相同，这给我们提示利用许多技术像定点突变、化学修饰、分子免疫来研究活性中心、受体绑定位点和作用位点。

此外，我们对东亚钳蝎抗癫痫类毒素多肽anti-epilepsy peptide1、anti-epilepsy peptide2、anti-epilepsy peptide3序列比对，发现序列一致性达87.57%。初级结构的高度保守性，提示功能区域、作用位点也可能存在某种相似性，这有助于我们进一步探明这一类毒素多肽功能位点，为临床治疗提供新策略。至今所知的抗痛多肽都属于长链蝎神经毒素，均不同程度影响细胞膜通道，是潜在的膜离子通道靶向工具，且很多抗痛类毒素均特异作用于昆虫，对哺乳动物无毒，蝎毒高选择性使得其在未来药物研发方面具巨大潜力。

图1 部分抗痛蝎毒素序列比对

2 抗痛蝎毒素多肽重组表达体系

研究各种不同的蝎毒素多肽结构功能对于未来生命医学及农业方面均具重要意义，但天然蝎毒素稀缺，价格昂贵。因此，从cDNA文库中筛选相关毒素多肽基因，体外重组表达蝎毒素蛋白，是充分利用毒素多肽资源，解析膜通道结构与功能分子特征的重要途径。目前已有的建立cDNA文库的蝎子种类有：Androctonus australis Hector(AaH),Buthus judaicus (Bj),Leiurus quinquestriatus Hebraeus(Lqh),Centruroides noxius(Cn),Tityus serrulatus(Ts),Buthus martensi Karsch(BmK)等。常见体外重组表达体系有原核细胞表达体系、真核表达体系，这为蝎毒素多肽的外源重组表达奠定了一定的理论及实践基础。

2.1 蝎毒素多肽的原核细胞表达体系

重组蝎毒素基因在原核细胞中的表达主要基于大肠杆菌原核表达体系，分为非融合表达和融合表达。在大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导pExsecI-rBmKCTα原核表达质粒表达，获得的可溶性目的蛋白的表达量占全菌总蛋白的19.94%，并具有良好的反应原性[12]。另有，使用质粒pExSecI，并给外源BmK Mm2基因N端融合进IgG抗体，外源表达纯化得到的BmK Mm2毒素蛋白，具生物活性并可作用于小鼠胶质瘤细胞[14，15]。东亚钳蝎BmKαIV是一种类α神经毒素，与BmK AS、BmK-IT2、BmKabT均作用于rNav1.2通道，调控Na+电流，以pET-28a为载体，实现了BmKαIV在BL21(DE3)中的可溶性表达[16]。此外，将长链钾通道毒素BmTXKβ cDNA序列插入pGEX-5x-1载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达，获得重组BmTXKβ蛋白约1 mg/L[17]。东亚钳蝎抗痛毒素BmKAS在大肠杆菌中异源表达，金属螯合住层析，表达量可达4.2 mg/L，且可显著抑制福尔马林引起小鼠双向自发痛[18-20]。也有人采用泛素降解标签在大肠杆菌中实现了重组东亚钳蝎镇痛抗肿瘤肽(rAGAP)融合表达，并进一步证明rAGAP具有明显抗痛效应[21]。此外，亦有研究证明rAGAP可以通过干扰p-AKT、NF-κB、BCL-2和MAPK信号通路及细胞周期抑制人类胶质瘤细胞SHG-44增殖与分化[22]。

2.2 蝎毒素多肽的真核表达体系

2.2.1 酵母表达系统

酵母作为真核表达系统比大肠杆菌具有更加完备的基因表达调控机制，尤其是酿酒酵母，安全性高，因此得到广泛研究和应用。东亚钳蝎哺乳动物神经毒素BmKM1在酿酒酵母中成功表达，表达水平达到5 mg/L培养液。研究者利用毕赤酵母密码子的偏爱性对BmKM1基因简并优化，克隆到pPIC9K载体中，甲醇诱导表达，使蝎毒镇痛活性肽基因BmKAngM1在毕赤酵母中高效表达[23]，使得采用真核表达有活性的蝎毒素蛋白极具操作性和预见性。另，将东亚钳蝎神经性毒素BmɑTX14构建到pPIC9K质粒，在毕赤酵母GS115中诱导表达，分离纯化，得到的毒素蛋白用膜片钳技术检测其电生理活性，结果显示重组BmaTX14作用下钠通道被一定程度激活[24]。

2.2.2 昆虫表达系统

昆虫杆状病毒表达系统所表达的蛋白具有正确的糖基化修饰和生物学功能。杆状病毒表达系统利用存在于高等真核细胞中的多种蛋白质修饰、加工和转运体系，超量表达可溶性重组蛋白，杆状病毒基因组较大(130 kb)，可以容纳较大的外源DNA片段，对脊椎动物没有感染性。目前已经部分用杆状病毒表达的蝎毒蛋白有AaIT、AaHIT、LqhaIT、LqhIT1和LqhIT2等[25，26]。苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)介导的重组杆状病毒表达兴奋性昆虫毒素BmKIT可以促进Sf9细胞凋亡，增强AcMNPV杀虫效应[27]。

2.2.3 哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞作为表达单抗及重组蛋白具优越性[28]。Dee等在鼠成纤维细胞NIH/3T3中表达了编码昆虫特异性蝎神经毒素AaIT的合成基因，在人白细胞介素-2信号肽的引导下得到分泌的毒素蛋白，该毒素蛋白对黄热蚊的幼虫具有毒性，而对鼠无毒[29]。

3 展望

蝎毒素多肽是解析蛋白质结构和功能关系的分子工具，在药理、病理、新型药物和杀虫剂等方面，展示出巨大的潜力和前景。天然蝎毒素蛋白分离纯化获得、仅限于结构简单的短肽链的化学合成，技术困难，成本昂贵，严重限制其空间及功能结构域的解析。重组蝎毒素基因的表达，可以较容易获得高纯度的蝎毒素蛋白以便进行研究和应用。因此，不断的优化蝎毒素基因外源表达条件，以期获得高活性表达产物，将为进一步研究其靶通道的药理毒理学机制提供良好基础。原核表达系统，缺乏转录后加工机制，表达真核蛋白容易形成不溶性包涵体，需变复性处理。选择合适的载体和宿主菌组合可提高目的蛋白可溶性部分比例及活性，可以与自身溶解性高的多肽序列融合表达，与催化二硫键形成的酶融合表达，与信号序列融合表达输出到细胞间质。因此，优化筛选原核表达体系，构建新型真核表达体系将成为高效抗痛蝎毒素多肽药物研发努力的方向。

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[责任编辑 李晓霞]

Recombination of Anti-pain Scorpion Toxin Polypeptides

RAN Qiu-hang,LIU XIA,YANG Qing-hu,BAI Zhan-tao*

(College of Life Sciences& Research Center for Peptide Drugs,Yan′an University;Engineering & Technological Research Center for Conversation & Utilization of Regional Biological Resources/Shaanxi Provincial Key Lab of Red Dates,Yan′an 716000,China)

Scorpion toxin peptides target on and regulate gating dynamics of multiple ion channels.Anti-pain scorpion toxin polypeptides are a kind of potential analgesic drugs.Sequence alignment analysis showed that the anti-scorpion toxin polypeptide performed about 45% sequence homology and three dimensional topology all combined by eight conservative scaffold cysteine residues,which may be corresponding to their anti-pain function.Moreover,gene recombinant and mutation of high-purity and high-activity polypeptides would be the more effective pathways to elucidate the conservation and active properties.The paper thus reviews the current recombination progressing and application of scorpion polypeptides to further our understanding to the structure-function relationship of natural anti-pain scorpion toxins.

scorpion toxin; anti-pain; sequence alignment; recombinant expression

2015-10-15

国家自然科学基金面上项目(81171038、81470051)；陕西省科技厅项目(2010JM4041、2012K01-12)；陕西省教育厅项目(12JS121、15JF034)；延安大学陕西省高水平大学建设项目(2012SXTS06)；延安市科技创新团队和榆林市科技计划项目(2015CXY-21)资助；延安大学2015年研究生教育创新项目(21)

冉秋行(1987—)，女，陕西西安人，延安大学硕士研究生。 *为通讯作者

Q784

A

1004-602X(2015)04-0073-04