组织工程骨的牛血清白蛋白残余量检测

邹文焘 刘广鹏

β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）是目前较为常用的骨组织工程支架材料，具有良好的生物相容性[1]和可降解性，构建的组织工程骨有望成为临床修复骨缺损的新方法[2-3]。组织工程骨的体外构建过程中常应用胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）作为细胞培养介质，而β-TCP的多孔支架结构易于吸附异种蛋白成分，因而会对组织工程骨临床应用的生物安全性造成影响。本文拟从β-TCP构建的组织工程骨牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）残余量的角度进行研究，为评价组织工程骨生物安全性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

磷酸三钙 （β-TCP）（上海组织工程研究与开发中心研制）；牛血清白蛋白酶联免疫试剂盒（无锡博生医用生物技术开发有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）、DMEM 低糖培养基（Gibco 公司，美国）；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、EDTA、地塞米松、β-磷酸甘油钠和维生素C（Sigma公司，美国）。

Beckman XL90低温离心机 （Beckman公司，德国）；TC-100B恒温水平摇床（上海领成生物科技有限公司）；Bio-Rad iMark 酶标仪（Bio-Rad 公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 hBMSCs分离培养

按文献[4-5]的方法，从正常人骨髓中分离纯化BMSCs，按1×106cells/cm2有核细胞的密度接种培养皿，加入含有10%胎牛血清的DMEM基础培养液，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。48 h后首次换液，以后隔日换液。原代细胞生长至80%融合时，0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化传代，继续培养扩增至第2代细胞，用于后续实验。

1.2.2 组织工程骨的体外构建

以 β-TCP 为支架材料（4 mm×4 mm×4 mm），环氧乙烷消毒后置于无菌培养皿内。取第2代hBMSCs，以1×106cells/mL的密度接种于β-TCP。每块材料接种10 μL细胞悬液，细胞数量为1×104个。将细胞材料复合物置于细胞培养箱4 h后，转移至96孔培养板，每孔加200 μL成骨诱导培养液（含低糖DMEM，10%FBS，10-8mol/L 地塞米松，10 mmol/L β-磷酸甘油钠和 10-4mol/L维生素C），37℃、5%CO2条件下继续培养。体外成骨诱导培养2周后，于检测前1 d更换为无血清的条件培养液，制备成待检测的组织工程骨样品。对照组为未接种细胞的β-TCP，同样置于200 μL成骨条件培养液中2周，检测前1 d更换为无血清的条件培养液。

1.2.3 酶联免疫分析法测定BSA含量

应用酶联免疫分析法测定标本中BSA含量。首先用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体。包被单抗的微孔中加入BSA抗原，经过结合、洗涤后加入酶标抗BSA抗体，洗涤后用显色剂显色。颜色的深浅和样品中的BSA呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品BSA浓度。

1.2.4 待测样品准备

1.2.4.1 细胞洗涤液的准备

第2代hBMSCs长满培养皿底部后常规消化，1 500 r/min离心5 min，弃去液体，细胞计数。添加10 mL PBS，重悬细胞，离心，收集PBS液体。再重复2次，获得3次细胞洗涤液待测。

1.2.4.2 组织工程骨样品的准备

取组织工程骨样品，以体积比1∶100的37℃生理盐水浸泡并洗涤3次，每次10 min，然后将样品置于滤纸上吸附残余液体，剪碎，称重，置于1.5 mL的Eppendorf管中。根据 《医疗器械生物学评价标准》中关于试验材料浸提液的规定标准[6]，每0.2 g样品加1 mL PBS平放固定于摇床，37℃、150 r/min振荡浸提24 h。对照组样品同法处理获取浸提液。每例样品吸取0.3 mL浸提液待测。另将组织工程骨样品3次浸泡冲洗后的生理盐水也分别取样待测。

1.2.5 BSA残余量测定

96孔酶标板（试剂盒自备）分别设标准孔、待测样品孔（复孔数均为2）。每孔分别加标准溶液或待测样品50 μL。轻轻混匀，37℃密封温育60 min。将酶标板取出弃去液体，甩干，每个孔中加洗涤液300~350 μL，反应30 sec后甩去液体，在滤纸上将酶标板拍干。重复此步骤3次。在标准品孔和样品孔中加入100 μL的酶标多抗溶液，20℃~25℃避光孵育30 min。洗板4次，拍干。依序每孔加底物溶液50 μL，20℃~25℃避光显色 10~15 min。 依序每孔加终止溶液50 μL，终止反应。10 min内酶标仪450 nm波长测量各孔的光密度（OD值）。

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用Microsoft Excel统计软件计算标准曲线的直线回归方程式，算出样品实际浓度。

1.3 统计学处理

采用Microsoft Excel统计软件，通过t检验对组织工程骨和单纯β-TCP材料的BSA残余量进行统计学分析，统计结果以s表示，P<0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 hBMSCs的分离、纯化、培养和传代

待测细胞为正常人第2代BMSCs（图1），长满培养皿底部时的细胞数量约为1.5~2×106个。

2.2 组织工程骨的体外构建

显微CT和扫描电镜观察可见β-TCP呈相互贯通的多孔网状结构，孔径为300~500 μm，孔隙率为（92.6±1.1）%。hBMSCs接种 β-TCP 后，体外继续成骨诱导培养2周，扫描电镜检测显示材料表面可见细胞分泌较多细胞外基质（图2）。

2.3 细胞洗涤液中BSA浓度

BSA检测试剂盒检测范围为0~40 ng/mL，根据其标准品测定的标准曲线R2=0.9832，符合试剂盒规定的R2>0.97的标准检测要求。

细胞洗涤液 BSA 浓度为（712.49±111.40）ng/mL、（38.69±26.20）ng/mL 和 （2.32±1.78）ng/mL，3 次结果的差异具有统计学意义（P<0.05，n=3，图 3）。

2.4 组织工程骨洗涤液BSA浓度

组织工程骨洗涤液中BSA含量，随洗涤次数增多而明显降低。3次洗涤液的BSA浓度分别为（305.86±93.41）ng/mL、（39.19±8.26）ng/mL 和（6.43±1.57）ng/mL，3 次结果的差异具有统计学意义（P<0.05，n=10，图 4）。

2.5 组织工程骨BSA残余量测定

实验组平均干重为（26.02±5.07）mg，对照组为（21.59±6.69）mg，两组差异无统计学意义（P>0.05，n=10，图5）。实验组平均BSA残余量为 （19.54±6.70）ng，单位重量的 BSA 残余量为（0.656±0.213）ng/mg。 对照组的相应值分别为 （15.67±5.49）ng和（0.796±0.205）ng/mg， 两组差异无统计学意义 （P>0.05，n=10，图 6）。

图1 BMSCs形态观察Fig.1 Histological observation of BMSCs

图2 β-TCP支架材料大体观及镜下观Fig.2 General observation and microscopic observation of β-TCP scaffold material

图3 细胞洗涤液BSA含量Fig.3 BSA content of in the dilution liquid of BMSCs

图4 组织工程骨洗涤液BSA含量Fig.4 BSA content of in the dilution liquid of tissue engineered bone

图5 每块样品BSA残余量Fig.5 The average residual BSA in tissue engineered bone

图6 单位重量样品BSA残余量Fig.6 The normalized residual BSA in tissue engineered bone

3 讨论

组织工程骨在构建过程中，其种子细胞的培养多需添加胎牛血清（FBS）；在细胞与支架材料的复合过程中，也需要FBS作为介质，提供细胞营养，维持细胞活性。生物支架材料的三维多孔性结构使材料内表面积增大，有利于细胞的黏附和生长，为细胞基质分泌与合成提供良好的外环境，又便于营养成分的运输及代谢产物的排出[7-8]。但同时也容易吸附培养液中的BSA等异种蛋白。BSA作为牛血清中含量最高的蛋白质成分，能够导致机体产生免疫排斥反应。因此，BSA残余量的多少关系到组织工程产品的安全性。

《中华人民共和国药典》（2010版三部）规定，人体疫苗的BSA残余量按酶联免疫方法进行检测，每件不超过50 ng[9]。目前，组织工程骨的国家标准尚未建立，相关的研究报道较少。本实验应用ELISA法检测常规消化后的细胞洗涤液中的BSA含量。结果表明，BMSCs洗涤液中BSA浓度随着洗涤次数的增加而明显降低；经过3次洗涤后，细胞洗涤液中的BSA残余量能够降至药典规定的BSA残余量上限。

进一步的实验显示，以β-TCP为支架的组织工程骨样品的BSA残余量平均值为19.54 ng。若修复骨缺损的材料体积为2 cm3，其规格大小对于临床应用而言并不是很大，但相应的BSA残余量将达到610.62 ng，这将远远超出药典的规定限量。而接种BMSCs的组织工程骨与未接种细胞的β-TCP材料相比，两者单位重量的BSA残余量无显著性差异，表明支架材料较种子细胞更为容易吸附残留BSA。

本实验表明，在种子细胞体外培养阶段，所使用的血清成分易于通过离心洗涤的方法予以去除；而当细胞与支架材料进行复合之后，由于支架材料会大量吸附培养基中的血清成分，此时难以再将血清从支架中分离出来。理想的清洗流程应在综合考虑最大限度清除残留BSA，并最大限度保留产品生物学活性之间取得平衡，以兼顾产品的安全性和有效性，这方面的研究目前尚未引起足够重视[10]。

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