噬菌体展示技术筛选小细胞肺癌细胞特异性结合多肽

梁 珍 姜 尧 石姣姣 侯春英 张 蕊 杨 楠 刘雁勇 左萍萍



噬菌体展示技术筛选小细胞肺癌细胞特异性结合多肽

梁 珍 姜 尧 石姣姣 侯春英 张 蕊 杨 楠 刘雁勇 左萍萍

目的 利用噬菌体七肽库，筛选出与小细胞肺癌细胞系H446细胞特异性结合的多肽。方法 利用噬菌体展示技术和小细胞肺癌细胞系H446细胞，经过多次3轮筛选，每次挑取12个噬菌体单克隆进行DNA测序，分析得到多肽序列，并利用免疫组织化学技术验证多肽的特异性。结果 多肽AF(AGALHQF)与小细胞肺癌病理组织有较高的亲和性。结论 噬菌体展示技术筛选的多肽AF可望为小细胞肺癌靶向治疗提供新的方向。

小细胞肺癌 噬菌体展示技术 多肽

小细胞肺癌是肺癌中恶性程度最高的肿瘤之一，每年15%肿瘤患者被确诊为小细胞肺癌[1]。因其倍增时间短，转移早而广泛，对化疗、放疗敏感，初治缓解率高，但极易发生继发性耐药，容易复发，故患者5年生存率极低，仅为12%[2,3]。化疗是治疗小细胞肺癌的基石，但大部分化疗由于药物特异性差，而出现骨髓抑制、呕吐等不良反应[4]。随着靶向治疗的出现，一些针对于小细胞肺癌生物学特征的靶向药物已经应用于临床，像基质金属蛋白酶抑制剂、沙利度胺等。但是，理想的治疗效果鲜少报道[5]。因此，寻找特异性强、敏感度高的靶分子显得尤其重要。

本研究主要以小细胞肺癌细胞系H446为靶分子，利用7肽噬菌体库进行体外筛选，从而获得小细胞肺癌细胞H446特异性结合的多肽，以期为小细胞肺癌靶向治疗提供新的策略。

材料与方法

1.材料: Ph.D.-7TM噬菌体展示肽库试剂盒(New England Biolabs公司，美国)。小细胞肺癌细胞系H446(中国医学科学院肿瘤医院，中国)。RPMI1640培养基和0.25%胰酶(中国医学科学院, 北京)。链霉素-FITC 和链霉素(Sigma公司, 上海)。DAPI和抗荧光衰减封片剂(中山金桥公司, 北京)。

2.方法: (1)细胞培养: 人小细胞肺癌细胞系H446细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃恒温，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。当细胞80%汇合时，进行传代。(2)特异性筛选: 消化、收集H446细胞，离心，弃上清，PBS洗3次。封闭缓冲液重悬细胞，4℃作用1h，离心，弃上清。然后，噬菌体肽库重悬细胞，室温下作用1h。TBST洗去未结合的噬菌体。之后，用洗脱缓冲液重悬细胞，室温下作用15min，离心，留上清，此即未扩增的噬菌体。然后，将噬菌体扩增，纯化，测效价，再进行下一轮淘选。(3) DNA测序: 取第3轮未扩增的噬菌体铺至IPTG/X-gal平板，随机挑选12个蓝斑进行扩增，提取噬菌体DNA，此即为噬菌体DNA模板。取适量模板进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察有无DNA条带，将观察到DNA条带的模板送至上海英俊进行测序。根据DNA序列推导出多肽序列。(4) 多肽特异性验证: 将出现次数最多的4个多肽序列委托上海吉尔生化公司进行合成，并将N端进行生物素标记。分别取人正常心、肝、脾、肺、肾正常组织及小细胞肺癌临床患者病理组织石蜡切片，将其脱蜡至水。25μg/ml链霉素中和内源性生物素，室温下将肽(1mg/ml, 稀释为1∶200)分别于各组织孵育1h。然后与FITC标记的链霉素(1mg/ml, 稀释为1∶100)室温下作用1h。DAPI和抗荧光衰减封片剂封片。荧光显微镜下观察结合情况。

结 果

1.特异性筛选：以小细胞肺癌细胞H446 为靶细胞，对Ph.D.-7TM 噬菌体展示肽库进行多次3轮筛选，1、2轮淘选效价测试为1011pfu/ml，均符合要求，3轮淘选为防止产生偏噬，不需扩增，直接提取测序，可得到与小细胞肺癌细胞H446特异性结合的噬菌体。图1为3轮洗脱物蓝斑照片。

图1 噬菌体展示3轮淘选洗脱物蓝斑

2.DNA提取：将提取到的DNA模板进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察发现大部分模板均出现条带(图2)，说明出现的蓝斑都含有DNA。

图2 DNA模板在琼脂糖凝胶中电泳情况

3.DNA序列测定：将琼脂糖凝胶中出现条带的DNA模板测序，结果显示噬菌体克隆中出现多种氨基酸序列，其中展示如下4种氨基酸序列的噬菌体被富集(表1)。

表1 噬菌体克隆序列分析

4.肽特异性验证：小细胞肺癌临床患者肿瘤组织和人心、肝、脾、肺、肾正常组织石蜡切片与各多肽孵育，荧光显微镜下观察结合情况。多肽AF与肿瘤组织显著性结合，而与正常组织极少结合，显著优于其他多肽，另外3个多肽与正常组织部分结合，详见图3。

图3 肽AF与小细胞肺癌临床患者肿瘤组织和人心、肝、脾、肺、肾正常组织结合情况A.SCLC肿瘤组织；B.心；C.肝；D.脾；E.肺；F.肾

寻找特异性强的靶分子，进而实现针对性的靶向治疗是现今肿瘤治疗的一个趋势。而低分子多肽，因其相对分子质量小，结构简单，穿透性强，免疫诱导弱，而越来越广泛作为靶向载体被人熟知[6]。以肿瘤组织某些异常表达的分子为靶分子，筛选出能与其特异性结合的低分子活性肽段，利用氨基酸分子的某些基团连接到药物上，从而提高疗效，降低毒性不良反应[7,8]。

噬菌体展示技术，自Smith创建以来，日益完善。在分离特异性与靶分子结合的多肽或抗体方面表现出强大的潜力。尤其是当靶分子为细胞时，这种分离的有效性较已知靶分子大大增加。因为细胞表面的结构很复杂，这样有利于筛选出共有序列[9,10]。已经有研究者利用这一技术得到特异性结合的肽或抗体。Jun等[11]利用噬菌体展示获得的肽所制备的靶向药物更好地被肿瘤细胞摄取。基于此，噬菌体展示技术目前广泛应用于各肿瘤的靶向研究中。

然而，噬菌体展示技术面临的挑战是所筛选出来的靶分子特异性不够强，最大限度地减少非特异性结合，而同时提高噬菌体的富集始终是改进这项技术的目标。目前，有研究者通过体内筛选，从而最大限度地还原肿瘤生长的环境[12]；更有研究者利用干细胞作为靶分子，以提高靶分子的特异性，从而改善了药物的体内分布情况[13]。

本研究初步鉴定肽AF与小细胞肺癌细胞系H446细胞具有较强的亲和力，同时发现其能与小细胞肺癌病理组织强特异性地结合。此发现表明可能筛选到一种新的小细胞肺癌相关抗原的配体。这将为靶向药物的制备提供新的靶分子，制备特异性更好的靶向药物。

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11 Jun Q, Yi Q,Xiu L,etal.specific targeting of A54 homing peptide-functionalized dextran-g-poly(lactic-co-glycolic acid) micelles to tumor cells[J]. Int J Nanomedicine,2015,10:665-675

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13 Yang N, Jiang Y, Zhang H,etal. Targeting docetaxel-PLA nanoparticles eradicate circulating cancer stem-like cells and inhibit liver metastasise[J]. Mol Pharm, 2015, 12(1):232-239

(修回日期：2015-03-20)

Screening of Small Cell Lung Cancer Cells Specific Polypeptide from a Phage Display Peptide Library.

LiangZhen,JiangYao,ShiJiaojiao,etal.

DepartmentofPharmacology,InstituteofBasicMedicalSciences,ChineseAcademyofMedicalSciences&SchoolofBasicMedicine,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China

Objective To obtain the polypeptides, which specifically recognize small cell lung cancer cells (SCLCs) from peptide libraries. Methods After several times of three rounds of biopanning by applying phage display technology in SCLCs H446 cells, we selected twelve clones to extract DNA, and then these DNA were sequenced and deduced to amine acid sequence. Immunohistochemical method was used to identify the specificity of these polypeptides. Results Polypeptide AF specifically recognized SCLC tissue section. Conclusion Polypeptides AF, obtained by phage displayed technology, potentially provides new strategy in the targeting treatment of small cell lung cancer.

Small cell lung cancer (SCLC)；Phage displayed technology；Polypeptides

国家重点基础发展计划项目(“973”计划项目)(2010CB934002)

100005 中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院药理室

左萍萍，教授，电子信箱：zuopp@126.com

R9

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.007

2015-03-02)