硫酸卡那霉素注射液含量测定的不确定度分析

于丽娜，徐嫄，韩宁宁，赵晖，郝利华

（中国兽医药品监察所，北京100081）

硫酸卡那霉素注射液含量测定的不确定度分析

于丽娜，徐嫄，韩宁宁，赵晖，郝利华

（中国兽医药品监察所，北京100081）

为研究微生物检定法（管碟法）测定硫酸卡那霉素注射液生物效价试验中各因素对结果的影响，采用不确定度分析，将影响因素归纳为称量、稀释、加样、测定、平行试验，量化各不确定度分量，评估各因素的影响因子。结果表明，牛津杯加样体积对测定结果影响最大，提示试验中应尽可能精确控制加样体积。

微生物检定法；硫酸卡那霉素注射液；效价；不确定度

目前，国际上通用的抗生素微生物检定法包括管碟法和浊度法。管碟法，又称杯碟法，是各国（兽）药典收载的经典抗生素微生物检定通用方法。管碟法操作步骤繁多，如何评估各操作步骤对测定结果的影响，从而提高管碟法的准确度是目前抗生素分析工作者所关心的问题之一。不确定度分析［1］通过对实验过程各个环节引入的不确定度进行评估，可分析各因素对测定结果的影响。目前广泛通用的不确定度评定模型是来自由ISO、IEC等七个国际组织联合发布的《测量不确定度评估指南》［2］中的模型，也是国际上第一个取得一致认同的模型。根据《JJF1059.1－2012测量不确定度评定与表示》［3］，本文对微生物检定法（管碟法）测定硫酸卡那霉素注射液生物效价的不确定度进行了分析和评估。

1 仪器与试药

CHB－1抗生素效价测量仪（北京潮声技术开发公司）；AX－205分析天平（瑞士Sartorius公司）；恒温培养室；硫酸卡那霉素标准品（USP标准品，775单位／mg，批号：35500J）与硫酸卡那霉素注射液供试品（某市售产品，规格10 mL∶1.0 g（100万单位）；Ⅰ号培养基（批号131105）；枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63501〕（中国兽医药品监察所）；磷酸二氢钾与磷酸氢二钾等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 取供试品3支，混合均匀，精密量取5mL，置50mL量瓶中，用灭菌水稀释至刻度，精密量取该溶液5mL，置50mL量瓶中，用灭菌水稀释至刻度，摇匀，制成每1mL中约含1000单位的溶液。精密量取该溶液（1000单位／mL）5 mL，置50 mL量瓶中，用磷酸盐缓冲液（pH 7.8）稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中约含100单位的溶液；再分别吸取该溶液（100单位／mL）2.00 mL，分置50 mL、100 mL量瓶中，分别用磷酸盐缓冲液（pH 7.8）稀释至刻度，摇匀，得到浓度分别为4单位／mL和2单位／mL的溶液，作为供试品溶液的高、低剂量。

2.2 标准品溶液的制备 精密称取硫酸卡那霉素标准品32.26 mg，置25 mL量瓶中，加灭菌水溶解并稀释至刻度，制成每1 mL中约含1000单位的溶液，稀释同供试品溶液制备项下，自“精密量取该溶液（1000单位／mL）……”起，同法操作。

2.3 双碟的制备与培养 取平底双碟约7套（n），分别加入加热融化的培养基20 mL，放置水平台上使凝固，作为底层。另取加热融化后的培养基适量，放冷至60℃，加入枯草芽孢杆菌的菌悬液适量，摇匀，在每一双碟中分别加入5 mL，摊布均匀，作为菌层。冷却后，在每一双碟中以等距离安置不锈钢小管4（k）个，待用。将上述稀释好的标准品溶液与供试品溶液分别滴加于不锈钢小管内，在35～37℃恒温培养室中培养14～16 h。

2.4 抑菌圈直径的测定与效价计算 取出培养好的双碟，用抑菌圈测量仪测量各个抑菌圈的直径，照生物检定统计法［4］进行可靠性检验与效价计算。当可靠性检验结果为回归非常显著（P＜0.01）与偏离平行不显著（P＞0.05）时，实验结果才成立。测定结果见表1。

表1 抑菌圈直径测量结果

3 测量不确定度评估

3.1 数学模型 效价由下式给出：

式中，P为供试品效价（相当于标示量或估计效价的百分含量），S2为标准品高浓度溶液所致的各抑菌圈直径（面积）的总和，S1为标准品低浓度溶液所致的各抑菌圈直径（面积）的总和，T2为供试品高浓度溶液所致的各抑菌圈直径（面积）的总和，T1为供试品低浓度溶液所致的各抑菌圈直径（面积）的总和，I为高、低剂量之比的对数，当剂量比为2∶1时，I＝log2／1＝0.3010，与所用碟数无关。

3.2 不确定度来源分析 对抗生素微生物检定法（管碟法）二剂量法的不确定度来源进行分析，主要分为可直接估算的不确定度和不可直接估算的不确定度。可直接估算的不确定度有：称量、稀释、加样、测定、平行试验。不可直接估算的不确定度有：标准品纯度、加样时间、培养温度。

3.3 可直接估算的标准不确定度

3.3.1 测量过程引入的不确定度

3.3.1.1 抑菌圈直径重复测量引入的不确定度分量u测量（1） 在二剂量法中，由于每份测定报告都是由N个培养皿组成，抑菌圈直径重复测量引入的不确定度分量为实际测量中供试品重复测量的标准偏差。对抑菌圈直径的测量结果进行统计分析，计算效价（y）为101.54单位／mg，同时统计分析得自由度f＝（k－1）（n－1）＝18，其合并样本标准差即标准不确定度为：

3.3.1.2 抑菌圈测量仪的不确定度分量u测量（2）自检报告显示，抑菌圈测量仪的最大允许误差为±0.03 mm，则区间半宽度αP＝0.03 mm，测量值落在该区间的概率分布为均匀分布，标准不确定度为0.03／3＝0.017 mm；抑菌圈测量仪的标准圈直径为19 mm，则相对标准不确定度为：

3.3.2 加样过程引入的不确定度 在本实验中，采用定量移液器向牛津杯中滴加抗生素溶液，加样体积的不确定度来自于：①定量移液器的系统允差；②定量移液器重复量取偏差；③温度校正引入的不确定度。

由厂商提供的信息可知，1 mL定量移液器的系统允差为±3.0%，则使用定量移液器量取0.27 mL液体的系统允差为±0.0081 mL，按矩形分布估计，标准偏差为：0.0081／3＝0.00468mL；使用定量移液器重复量取10次，标准偏差为0.00372 mL；定量移液器应在23℃校准，量取抗生素溶液时温度为25℃，与校准温度有2℃的温差，在95%的置信区间下，按均匀分布计，则标准偏差为

因此，使用定量移液器滴加抗生素溶液时，由加样体积引入的合成不确定度为：

3.3.3 溶液配制引入的不确定度

3.3.3.1 量瓶、移液管的相对标准不确定度 根据《常用玻璃仪器检定规程》［5］查得，A级100 mL、50 mL、25 mL单标线容量瓶的允许误差分别为：±0.10 mL、±0.05 mL、±0.03 mL，以B类不确定度计算，按三角分布估计，则标准偏差分别为：0.10／6＝0.0408mL，0.05／6＝0.0204mL，0.03／6＝0.0122mL；A级5mL和2 mL移液管最大允差分别为0.015 mL和0.010 mL，按B类不确定度评定，假定为三角形分布，则标准偏差分别为：0.015／6＝0.006 mL，0.010／6＝0.004 mL；配制溶液时，实验室温度接近15℃，容量器皿校准温度为23℃，在95%的置信区间下，按均匀分布计，则标准偏差为±2.5×2.1× 10－4×8／3＝0.0024 mL；因此，100 mL量瓶的相对标准偏差为：3.3.3.2 溶液配制的不确定度us（稀释） 标准品溶液配制过程中分别使用100 mL（V∗1）、50 mL（V∗2）、25 mL（V∗1）量瓶，5 mL移液管（V∗1）、2 mL移液管（V∗1），则如公式（1）。

供试品溶液配制过程中分别使用100mL（V∗1）、50 mL（V∗4）量瓶，5 mL移液管（V∗1）、2 mL移液管（V∗1），则如公式（2）。

3.3.4 称量／取样引入的不确定度

3.3.4.1 标准品取样引入的不确定度 标准品为固体，采用称量取样，不确定度主要来自于：①称量偏差；②天平校正偏差。

（1）称量偏差：使用天平对同一质量恒定的物体（1 g，标准砝码）反复称量10次，其标准偏差为0.0099 mg。

（2）天平校正偏差：天平（AX205，d＝0.01 mg）检定证书标明其最大允差为0.10 mg，按矩形分布估计，校准不确定度为0.10＝0.0577mg，上述分量必须计3

算2次，一次作为空盘，一次作为毛重，因为每次称量均为独立的观测结果，两者的线性影响不相关，因此

则标准品取样的合成不确定度为：3.3.4.2 供试品取样引入的不确定度 供试品为注射剂，采用5 mL移液管取样，如前述，不确定度uT（取样）为0.0013。

3.3.5 平行试验引入的不确定度uc（平行） 根据《兽药检验操作规程》“HYZY081－2011化学原料药和制剂的含量测定法”规定，含量（效价）测定至少平行测定两份。因此，平行量取供试品2份，同时操作，测定结果见表2，取两次测定的平均值作为硫酸卡那霉素效价的测定结果，采用极差法对平行测定引入的不确定度进行评估。

表2 注射用硫酸卡那霉素平行测定结果

式中，A为1号供试品测得的效价比值；B为2号供试品测得的效价比值。

3.4 总合成标准不确定度u（x）rel

3.5 扩展不确定度U 将合成标准不确定度乘以一个给定概率的包含因子（k），得到扩展不确定度［6］。本文采用置信概率为95%的包含因子（k95），根据t分布表，取k＝2，则扩展不确定度为：u（x）／x＝0.024，x＝10.09万单位／mL，u（x）＝0.024× 10.09万单位／mL＝0.24万单位／mL。取k＝2，则扩展不确定度为U＝2u（x）＝2×0.24万单位／mL＝0.48万单位／mL。

硫酸卡那霉素效价测定的结果可表示为：（10.09±0.48）万单位／mL（95%置信限）。

4 讨论与小结

按照《中国药品检验标准操作规范》［7］，二剂量法加样顺序为：高浓度标准品溶液→高浓度供试品溶液→低浓度标准品溶液→低浓度供试品溶液，每次滴加的溶液应为同一浓度，双碟数不超过5个，如样品溶液滴加双碟数目多，可分组滴加。对于不同的操作者而言，加样方法略有不同。由加样时间引入的不确定度对测定结果的影响为系统误差，在试验中，应尽量减少加样时间，以将该因素的影响控制在最小，在不确定度分析中做零项处理［8］。恒温培养室大小约为3m×1.5m，房间密闭，同时布有温度检测探头，温度区间为35～37℃，通过长期观察记录，温度可稳定在35～37℃，因此，培养温度对测定结果的影响可忽略不计。

综上所述，各因素对测定结果影响如下：加样体积＞平行试验＞供试品／标准品溶液的配制＞标准品称量＞抑菌圈重复测量＞抑菌圈测量仪＞供试品取样。由此可见，当供试品为液体时，采用移液管取样，供试品取样引入的不确定度最小，仪器引入的不确定度次之，而牛津杯中的加样体积，则是影响测定结果的关键因素。本文为分析微生物检定法（管碟法）测定抗生素生物效价不确定度提供了可靠的方法，并为如何提高抗生素效价测定结果的准确度提供了参考依据。

［1］ 刘建坤，朱家平，郑荣.测量不确定度评定研究现状及进展［J］.现代科学仪器，2013，10（5）：12－17.

［2］ ISO 1993（E）.Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement［S］.

［3］ JJF1059.1－2012.测量不确定度评定与表示［S］.

［4］ 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典一部［S］.2010年版.

［5］ JJF1059.1－2012.玻璃仪器检定规程［S］.

［6］ 粟晓黎，李冠民，金少鸿.药品检验一般检测项目不确定度评定研究－1.B类评定［J］.药物分析杂志，2005，25（6）：699－705.

［7］ 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范［M］.北京：中国医药科技出版社，2010.

［8］ 常艳.抗生素标准品的定值及其不确定度评定［D］.北京：北京协和医学院研究生院，2011.

（编辑：李文平）

Evaluation of Uncertainty of Determ ination of Kanam ycin M onosulfate for Injection by the M icrobiological M ethod

YU Li－na，XU Yuan，HAN Ning－ning，ZHAO Hui，HAO Li－hua
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China）

To evaluate the uncertainty of determination of kanamycin monosulfate for injection by the microbiological method in Chinese Veterinary Pharmacopoeia（edition 2010），a mathematied model was established to evaluate the factors affecting sample determination.Each componentof uncertainty was calculated by analyzing the various variable parameters among the procedures.The combined uncertainty was finally obtained by synthesizing the uncertainties of various component variables.The volume of sample added into Oxford Cup effects resultmost.As a result，the added volume should be controlled accurately in the test.

microbiologicalmethod；kanamycin monosulfate for injection；biological value；uncertainty evaluation

2014－11－24

A

1002－1280（2015）02－0040－04

S859.79

于丽娜，硕士，从事药物分析及检验工作。E－mail：yulinachina＠163.com