人长链非编码RNA基因H19克隆、表达载体构建及对MCF-7细胞增殖的影响

彭 艳，谢海棠，孙 红,2，曾 樱，朱琼妮，李泰霖，王 果，朱院山

(1.中南大学湘雅医院临床药理研究所，湖南 长沙 410008；中南大学临床药理研究所，遗传药理学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410078;2.福建医科大学省立临床学院药学部，福建 福州 350001; 3.皖南医学院弋矶山医院临床药学部，安徽省药物临床评价中心，安徽 芜湖 241001)

人长链非编码RNA基因H19克隆、表达载体构建及对MCF-7细胞增殖的影响

彭 艳1，谢海棠3，孙 红1,2，曾 樱1，朱琼妮1，李泰霖1，王 果1，朱院山1

(1.中南大学湘雅医院临床药理研究所，湖南 长沙 410008；中南大学临床药理研究所，遗传药理学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410078;2.福建医科大学省立临床学院药学部，福建 福州 350001; 3.皖南医学院弋矶山医院临床药学部，安徽省药物临床评价中心，安徽 芜湖 241001)

目的 克隆人长链非编码RNA H19基因，构建表达载体，研究H19表达对MCF-7增殖的影响作用。方法 制备乳腺癌MCF-7细胞总RNA，RT-PCR扩增长链非编码RNA H19全长序列，分子克隆至pcDNA3.1(-)真核表达载体；分别转染HEK-293T和COS 7细胞并行Real-time qPCR验证载体构建是否成功；转染H19表达载体入MCF-7细胞株，转染0、24和48 h后行MTS检测H19表达，同时设计siRNA小分子片段干扰H19的表达，观察对MCF-7细胞增殖活性的影响。结果 成功克隆和构建了hH19-pcDNA3.1(-)表达载体；转染入MCF-7细胞48h后，H19过表达，MTS检测H19表达载体组吸光度明显高于空载体组和空白对照组；而转染H19 siRNA小分子片段后能干扰其表达，同时抑制细胞增殖。 结论 H19过表达能够促进乳腺癌MCF-7细胞增殖。

长链非编码RNA；H19基因；基因克隆；瞬时转染；HEK-293T细胞；COS-7细胞；MCF-7细胞

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)定义为一类长度大于200nt、但不编码产生蛋白质的RNA转录产物[1-2]，研究表明lncRNA与多种类型的肿瘤发生发展有着密切联系，已成为近年来的研究热点之一[3]。人lncRNA基因H19位于人染色体11p15.5，全长2.3kb，是最先被报道的lncRNA基因之一[4]。同时该基因为最早发现的印记基因之一，其父系基因印记，母系基因表达。H19基因进化上高度保守，胚胎发育期高表达，婴儿出生后在大多数组织表达下调，仅在骨骼肌和心肌中有少量表达[5-7]。近年研究表明，H19与肿瘤具有密切关联，在不同的癌症中作用不一致，在某些肿瘤中表现为促进肿瘤发展，但在另外一些肿瘤中则表现为抑癌基因功能。在大多数肿瘤中，例如乳腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、肝癌和转移肝癌中H19高表达，表现为促进肿瘤的生长[8-13]；而在结直肠癌和胚胎性肿瘤细胞株中H19的表达抑制了肿瘤生长[13-15]。近期研究表明，H19基因的表达还可能与肿瘤化疗耐药的调控机制相关，例如在多柔比星耐药的肝癌HepG2细胞中，H19表达上调，并通过降低MDR1基因启动子甲基化水平从而上调p-糖蛋白表达而产生多药耐药[16]。为进一步探讨H19表达对乳腺癌的发生、发展以及多柔比星化疗耐药的作用，本文克隆了该基因并构建了H19真核表达载体，并转染MCF-7细胞，过表达和干扰H19，探讨H19表达增加和降低对MCF-7细胞增殖的影响。本文的工作为我们后续研究H19在乳腺癌发生，发展以及化疗耐药过程中的作用和分子机制奠定了实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞及主要试剂 MCF-7、HEK-293T和COS 7细胞系均为本研究所冻存；限制性内切酶Bam HⅠ、HindⅢ、BbvcⅠ及T4连接酶购自NEB公司；总RNA提取试剂盒和无内毒素质粒提取试剂盒购自Omega公司；胶纯化回收试剂盒、pGEM-T easy载体和MTS试剂购自Promega公司；胎牛血清购自Hyclone公司；RPMI 1640(高糖)、DMEM(高糖)、胰酶、OPTI-MEM、DPBS和脂质体LipofectamineTM2000购自Life Technologies公司；LA Taq DNA聚合酶、GC Buffer、DNA分子量标准品、逆转录试剂盒、Real-time qPCR试剂盒购自TaKaRa公司；DH5α超级感受态细菌购自北京全式金公司；无水乙醇、氯仿等有机试剂均为国产分析纯；pcDNA3.1(-)空载体由本研究所屈健博士提供；siRNA H19小分子片段由广州锐博公司合成。引物由上海博尚生物技术有限公司合成。

1.1.2 主要仪器 PCR仪为Eppendorf公司产品；凝胶电泳仪及成像系统为Bio-Rad公司产品；Real-time qPCR仪为Roche公司产品；微量分光光度计为NanoDrop公司产品；荧光倒置显微镜为Nikon公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HEK-293T细胞和COS 7细胞培养基为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，MCF-7细胞培养基为含10%胎牛血清的RPMI 1640高糖培养基，3株细胞的培养条件均为37℃，5%CO2。

1.2.2 hH19基因全长序列克隆 根据Gen Bank数据库hH19标准序列NR_002196.1设计引物，因该RNA序列长2.3kb，故进行分段克隆。在上下游片段正向扩增引物中均引入BamH Ⅰ切点，在下游片段反向引物中均引入Hind Ⅲ切点，引物序列及说明见Tab 1。试剂盒制备MCF-7细胞总RNA，取1 μg总RNA用随机引物行逆转录。50 μL PCR体系：上下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL，2×GC Buffer 25 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1each)8 μL，LA Taq DNA聚合酶 0.5 μL，逆转录产物2 μL，ddH2O 补足50 μL。循环条件：94℃预变性1 min；94℃变性30s，60℃退火30 s，72℃ 延伸2 min，30个循环；72℃ 终末延伸5 min；产物保存于4℃。1%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物并行纯化回收，产物连入pGEM-T easy载体，转化DH5α超级感受态细胞，行蓝白斑筛选，挑取白色克隆，经T7和SP6通用引物对PCR鉴定后，制备插入片段阳性克隆质粒，进行测序验证。

1.2.3 构建人H19表达载体 BamH Ⅰ+Hind Ⅲ消化测序验证正确的hH19上游片段-T easy质粒以及pcDNA3.1(-)载体，分别纯化回收目的片段。连接线性化载体和hH19上游片段，转化DH5α感受态细胞，T7和BGH通用引物对行菌液PCR鉴定，得到插入片段阳性克隆，命名为hH19上游片段-pcDNA 3.1(-)。BbvC Ⅰ+Hind Ⅲ消化H19上游片段-pcDNA 3.1(-)质粒和hH19下游片段-T easy质粒，连接线性化表达载体和H19下游片段，转化感受态细胞，挑克隆，双酶切鉴定，得到包含完整，正确hH19基因序列的hH19-pcDNA3.1(-)表达载体。用无内毒素试剂盒大量制备质粒。

Tab 1 Primers used in the present study

1.2.4 hH19表达载体瞬转HEK-293T和COS-7细胞及qPCR检测 HEK-293T和COS-7细胞分别消化成单细胞悬液，2×105细胞接种1个6孔板孔。按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行转染操作，hH19表达载体质粒用量为4.0 μg，LipofectamineTM2000用量为10 μL，并设置只加等量转染试剂组和pcDNA3.1(-)空载体组作为对照。各组细胞转染24 h后提取总RNA，随机引物行逆转录。Real-time qPCR检测hH19表达，GAPDH为内对照。20 μL qPCR体系：2×SYBR Premix Dimer Eraser 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1) 各0.6 μL，cDNA 2 μL，ddH2O补足20 μL。循环参数：95℃，30 s；95℃，5 s，55℃，30 s，72℃，30 s，40次循环；最后65℃，15 s以及溶解曲线检测。细胞瞬转与H19表达检测实验重复3次。

1.2.5 过表达H19对MCF-7细胞增殖的影响以及qPCR检测H19 mRNA表达 MCF-7细胞以1×104细胞接种于1个96孔板孔，待细胞贴壁后转染hH19-pcDNA3.1(-)载体至细胞，并设置pcDNA3.1(-)空载体组和转染试剂组作为对照，转染0、24、48 h后，吸除孔内培养基，每孔加入含有MTS试剂的培养基40 μL，37℃培养30 min后检测每孔吸光度。MCF-7细胞以2×105细胞接种于1个6孔板孔，待细胞贴壁后转染hH19-pcDNA3.1(-)载体至细胞，并设置pcDNA3.1(-)空载体组作为对照，转染24、48 h后提取总RNA，随机引物行逆转录。Real-time qPCR检测hH19表达，GAPDH为内对照。细胞转染、MTS检测和qPCR检测实验重复3次，每次重复时每组设置3个复孔。

1.2.6 siRNA H19小分子片段干扰H19表达后对MCF-7细胞增殖的影响以及qPCR检测H19 mRNA表达 MCF-7细胞以1×104细胞接种于1个96孔板孔，待细胞贴壁后转染siRNA H19小分子片段至细胞，并设置siRNA H19反义链和1条无意义的小分子片段作为对照，转染24 h后，吸除孔内培养基，每孔加入含有MTS试剂的培养基40 μL，37℃培养30min后检测每孔吸光度。MCF-7细胞以2×105细胞接种于1个6孔板孔，待细胞贴壁后转染siRNA H19小分子片段至细胞，并设置siRNA H19反义链和1条无意义的小分子片段作为对照，转染24 h后提取总RNA，随机引物行逆转录。Real-time qPCR检测hH19表达，GAPDH为内对照。细胞转染、MTS检测和qPCR检测实验重复3次，每次重复时每组设置3个复孔。

2 结果

2.1 hH19基因克隆与序列测定以cDNA为模板，分别用引物对F1/R1和F2/R2 扩增，得到与预期片段大小相符的特异性片段(Fig 1A)。切胶纯化回收目的片段，并与pGEM-T easy载体连接，插入阳性的重组质粒 H19上游片段-pGEM-T easy和H19下游片段-pGEM-T easy经酶切鉴定正确(Fig 1B)。测序结果显示，载体中H19基因上游片段扩增长1417 bp、下游片段扩增长1162 bp与已知的NCBI基因库中人H19(NR_002196.1)序列一致。

2.2 hH19-pcDNA3.1(-)表达载体构建H19上游片段-pGEM-T easy经BamH Ⅰ+Hind Ⅲ双酶切，与同样双酶切线性化的pcDNA3.1(-)载体连接，得到的表达载体H19上游片段-pcDNA3.1(-)载体；再将H19下游片段-pGEM-T easy载体和H19上游片段-pcDNA3.1(-)载体分别行经BbvC Ⅰ+Hind Ⅲ双酶切后连接，从而将H19下游片段插入至H19上游片段-pcDNA3.1(-)载体中，得到完整的hH19-pcDNA3.1(-)表达载体。经BamH Ⅰ+Hind Ⅲ双酶切鉴定(Fig 1C)和测序鉴定，确认载体构建成功。

2.3 Real-time qPCR检测转染后HEK-293T细胞和COS-7细胞中H19基因表达利用阳离子脂质体将hH19-pcDNA3.1(-)表达载体和对照组pcDNA3.1(-)空载体分别转染至HEK-293T细胞和COS-7细胞。转染24 h后，行Real-time qPCR检测各组中H19表达，HEK-293T细胞和COS-7细胞转染组的H19表达水平相对未转染组分别提高352和820倍(Fig 2A)。qPCR产物经电泳检测显示产物条带特异，片段大小与预期结果相符，产物特异(Fig 1D)，进一步测序结果确认为qPCR扩增产物为H19基因片段。证明所构建的H19表达载体转染真核细胞内后可正常表达。

Fig 1 Agarose gel electrophoresis pictures of H19 expression vector construction

A: Cloning of H19 gene by PCR and agarose gel electrophoresis result. M—DNA maker; 1—PCR product of H19 up gene; 2—PCR product of H19 down gene. B: Restriction analysis of pGEM-T easy-H19 up and pGEM-T easy-H19 down and agarose gel electrophoresis result. M—DNA maker; 1,2—Digestion of pGEM-T easy-H19 up by BamH I+Hind III; 3,4—Digestion of pGEM-T easy-H19 down by BamH I+Hind III. C: Restriction analysis of pcDNA3.1(-)-H19 and agarose gel electrophoresis result. M—DNA maker; 2—Digestion of pcDNA3.1(-)-H19 by BamH I+Hind III; 3—Digestion of pcDNA3.1(-)by BamH I+Hind III. D: Identification of real-time PCR specificity primer for GAPDH gene by PCR and agarose gel electrophoresis result. 1—DNA maker; 2—Real time PCR specificity primer for GAPDH gene.

2.4 过表达H19基因对MCF-7细胞增殖的影响转染H19表达载体到MCF-7细胞，24和48 h后qPCR均能检测到高表达的H19 mRNA，且差异有统计学意义(Fig 2B)。但H19过表达24 h后对细胞增殖的影响差异无统计学意义，而到48 h后对细胞增殖的影响差异有统计学意义，实验结果表明，H19可以促进MCF-7细胞的增殖(Fig 2C)。

Fig 2 Results of H19 expression vector transfected into cells

A: Relative expression level of H19 mRNA in HEK-293T and COS-7 transfected with recombinant plasmid pcDNA3.1(-)-H19. none —transfected cells; pcDNA3.1(-)—transfected with empty plasmid; pcDNA3.1(-)-H19—transfected with expression vector plasmid pcDNA3.1(-)-H19. B: Relative expression level of H19 mRNA in MCF-7 transfected with recombinant plasmid pcDNA3.1(-)-H19.*P<0.05vspcDNA3.1(-); C: The influence on the proliferation of H19 expression vector plasmid transfected into MCF-7.*P<0.05vspcDNA3.1(-).

Fig 3 Results of H19 siRNA interference fragment transfected into cells

A: Relative expression level of H19 mRNA in MCF-7 transfected with H19 siRNA interference fragment. Non control—cells without H19 oligonucleotides transfection; siRNA H19 (sense)—sense H19 oligonucleotides transfection; siRNA H19 (antisense) —antisense H19 oligonucleotides transfection.*P<0.05vssiRNA H19(antisense) and non control; B: The influence on the proliferation of H19 siRNA interference fragment transfected into MCF-7.*P<0.05vssiRNA H19(antisense) and non control.

2.5 siRNA 小分子片段干扰H19基因对MCF-7细胞增殖的影响转染H19 siRNA小分子干扰片段到MCF-7细胞，24 h后qPCR检测到H19被干扰70%左右，差异具有统计学意义(Fig 3A)。H19干扰24 h后观察到能够抑制细胞增殖且差异具有统计学意义，实验结果表明，干扰H19可以抑制MCF-7细胞的增殖(Fig 3B)。

3 讨论

近年来的研究表明，H19与肿瘤的发生发展及转移有着密切的联系，如：在肺癌和肝癌中发现H19和Slug相互作用促使肿瘤细胞由上皮细胞向间质细胞转移，从而增加其侵袭能力[17]；在卵巢癌中，敲除H19能够使其癌细胞生长速度减慢[18]；而在胃癌细胞和胃癌组织中，H19的表达都明显增加，有学者认为H19的上调促使细胞增殖同时伴随着部分p53的失活[19]，另外有学者也认为H19能直接上调ISM1或者通过miR-675抑制CALN1的表达来促使胃癌的增殖、迁移、侵袭和转移[20]。另外在肝癌细胞、肺癌细胞和乳腺癌耐药细胞(MCF-7/AdrVp)中相对于其亲本细胞均检测到了高表达的H19，表明H19与肿瘤细胞多药耐药密切相关[21]。

为了能更深入的探讨H19基因与肿瘤细胞的关系，本实验克隆了H19基因，并构建了H19的真核表达载体，用脂质体介导转染入HEK-239T细胞和COS-7细胞，发现在HEK-293T细胞和COS-7细胞中H19基因的表达极低，转染后表达量分别升高352和820倍(与转染的空载体相比较)，能够满足进一步的实验需要。然后在肿瘤细胞MCF-7细胞过表达和干扰H19的表达，发现过表达H19后能够促进肿瘤细胞MCF-7细胞的增殖，而干扰H19的表达则抑制其增殖。我们发现转染H19表达载体24 h后就检测到了H19上调并且比48 h上调得多，但是24 h对细胞的增殖影响不明显，而48 h后能明显促进细胞增殖，且具有统计学意义。初步推测H19可能不是直接影响细胞增殖，而是通过调控其下游的元件来影响细胞增殖，而这种影响存在时间差异，因此我们在H19过表达24 h后即检测到了其上调，但48 h才观察到了明显的细胞增殖。而siRNA小片段干扰，在24 h就检测到了H19表达下调并且明显抑制细胞的增殖，初步推断siRNA小片段干扰的效率高，不到24 h就干扰了H19从而调控下游元件抑制细胞增殖。而且H19干扰后能抑制细胞增殖，干扰时间太长，细胞都死亡，因此我们实验中只做了24 h的时间点。

综上所述，本文成功的克隆了H19基因，构建了H19的真核表达载体，高效转染HEK-293T细胞和COS-7细胞并检测到H19基因的表达。同时转染入MCF-7细胞中发现H19能够促进细胞的增殖，而干扰H19能抑制细胞增殖，为下一步探讨H19对乳腺癌的影响提供思路和奠定基础。

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Constructing an expression vector for human lncRNA H19 and the effect of its overexpression on MCF-7 cell proliferation

PENG Yan1, XIE Hai-tang3，SUN Hong1,2, ZENG Ying1, ZHU Qiong-ni1,LI Tai-lin1, WANG Guo1, ZHU Yuan-shan1

(1.DeptofClinicalPharmacology,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China;InstituteofClinicalPharmacology,CentralSouthUniversity,HunanKeyLaboratoryofPharmacogenetics,Changsha410078,China;2.DeptofPharmacy,ProvincialClinicalCollegeofFujianMedicalUniversity,FujianProvincialHospital,Fuzhou350001,China;3.InstituteofClinicalPharmacyandPharmacology,YijishanHospitalofWannanMedicalCollege,WuhuAnhui241001,China)

Aims To construct an expression vector of human lncRNA H19, and to determine the effect of H19 overexpression on MCF-7 cell proliferation. Methods Total RNA was extracted from MCF-7 cells, and the full-length of H19 lncRNA was amplified by RT-PCR and subcloned into pcDNA3.1 (-) expression vector. The constructed H19 expression vector was transfected into HEK-293T and COS-7 cells and the H19 lncRNA expression was evaluated by real-time PCR. Following the transfection of H19 expression vector into MCF-7 cells for 0, 24h and 48h and H19 siRNA interference fragment into MCF-7 cells for 24h, MCF-7 cell proliferation was determined by MTS assay. Results A hH19-pcDNA3.1 (-) expression vector was successfully constructed. At Forty-eight hours after the transfection with H19 expression vector in to MCF-7 cells, cell proliferation was significantly increased in the transfected group compared to those without transfection and to those transfected with a negative control vector, while twenty-four hours after the transfection with H19 siRNA interference fragment into MCF-7 cells, cell proliferation was significantly decreased in the transfected group compared to those transfected with a negative control vector. Conclusion Ectopic overexpression of H19 lncRNA can promote breast cancer MCF-7 cell proliferation.

lncRNA; H19 gene; gene cloning; transient transfection; HEK-293T; COS-7; MCF-7

时间：2015-3-16 15:41 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.004.html

2014-11-10,

2014-12-10

国家自然科学基金资助项目(No 81072706、81173134、81403021)；湖南省科技计划项目 (No 2013FJ3036)；中南大学特殊人才基金

彭 艳(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：遗传药理学和临床药理学,Tex：0731-84805380, E-mail：pengyan902@126.com； 王 果(1973-)，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：遗传药理学和临床药理学，通讯作者，Tex：0731-84805380，E-mail: 207082@csu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.023

A

1001-1978(2015)04-0555-06

R329.24；R342.2；R394.2；R737.902.2