针刺对缺血缺氧性脑瘫乳鼠的治疗作用*

李素慧， 孙洪涛， 王延民， 魏正军

(1. 武警后勤学院附属医院仪器设备科， 2. 武警后勤学院附属医院脑科医院， 天津 300162)



针刺对缺血缺氧性脑瘫乳鼠的治疗作用*

李素慧1， 孙洪涛2△， 王延民2， 魏正军2

(1. 武警后勤学院附属医院仪器设备科， 2. 武警后勤学院附属医院脑科医院， 天津 300162)

目的：探讨针刺治疗促进脑瘫乳鼠运动功能恢复的作用机制。方法：采用改良的缺氧缺血性脑病(HIE) 造模方法建立脑瘫乳鼠模型，将60只乳鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组 (n=20)，观察各组乳鼠运动功能情况并评分，测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量，检测大脑病变区域的突触素(SYP)和神经生长相关蛋白(GAP-43)的表达。结果：针刺治疗组运动功能评分较模型组运动功能评分显著增加(P<0.05)；血清SOD活性较模型组显著增加(P<0.01)；血清MDA含量较模型组MDA含量明显降低(P<0.01)；脑组织SYP和GAP-43的表达较模型组SYP和GAP-43活性的表达明显增加(P<0.05)。结论：针刺疗法能通过降低MDA的活性、升高SOD的含量、进一步上调病变部位的大脑皮质区的SYP及GAP-43 的表达从而改善缺血缺氧性脑瘫乳鼠的运动功能。

针刺治疗；脑性瘫痪；生长相关蛋白；突触素；乳鼠

脑瘫患儿的治疗及功能恢复是目前医学界研究的重点和难点，针灸作为传统的中医治疗方法，在脑性瘫痪的临床治疗中广泛应用，其对脑瘫患者运动功能的恢复起到了一定的治疗效果[1，2]，但对于针刺治疗的作用机制研究较少。本研究建立脑瘫乳鼠模型，采用针刺治疗，对乳鼠进行运动功能评估，并对乳鼠血清血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde ，MDA)含量和大脑病变区域(synaptophysin，SYP)神

经生长相关蛋白(growth associated protein-43,GAP-43)的表达情况进行检测，观察针刺治疗的效果，探讨针刺疗法促进脑瘫乳鼠运动功能恢复的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

购自于北京中山生物工程有限公司的抗GAP-43和抗SYP单克隆抗体、SAB试剂盒、DAB显色试剂盒；购自于南京建成生物研究所的SOD和MDA试剂盒。日本Olympus手术显微镜；美国HMIAS-2000型图像分析系统。

1.2 实验动物与分组

7日龄新生SD乳鼠(清洁级，天津医科大学动物实验中心提供)60只，雌雄各半，平均体重(15.5±1.1)g，在20℃～22℃相对湿度45%～50%的动物房中饲养，光照周期10～12 h。将乳鼠随机分为三组 (n=20)：假手术组、模型组及针刺组，且每组动物再随机分为14 d和28 d两个亚组(n=10)。分组结束后，将其送回各自母鼠笼中继续母乳喂养。

1.3 模型制备

采用改良的缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)实验动物造模方法[3]。将模型组及针刺组乳鼠仰卧位置于手术板上，采用10%的水合氯醛 (4 ml/kg) 进行腹腔麻醉。先将乳鼠的四肢及头部固定，碘伏消毒，取颈前正中切口，分离左颈总动脉。选用0号线埋线结扎，缝合切口后立即将乳鼠放置于37℃水封闭的缺氧箱中(箱内持续充以体积浓度为92%氮气和8%氧气的混合气体，气体流量为 1 L/min)，2.5 h后取出，继续保温1 h后观察乳鼠的行为，若乳鼠行走时向手术对侧转圈或向手术对侧倾倒走路不稳，即可认定为脑瘫模型制作成功。假手术组乳鼠只取颈前正中切口，分离出左颈总动脉，不做结扎只缝合切口。

1.4 针刺组治疗方法

术后24 h开始针刺治疗，根据“动物针灸穴位图谱”(中国针灸学会实验针灸研究分会制定)选穴。针刺取穴：百会、合谷、曲池、前三里、后三里、涌泉；针刺方法：从上到下，从左至右，毫针浅刺，每次穴位针刺3 min，不留针，每天1次，连续28 d。

1.5 观察指标及测定方法

1.5.1 运动功能评估 分别于针刺后14 d及28 d从各组随机选出10只乳鼠，对其进行BBB运动功能等级评分[4]，评估其运动功能。评分共分三部分：第一部分为0～7分，评判动物后肢各关节活动；第二部分为8～13分，评判后肢的步态及协调功能；第三部分为14～21分，评判运动中爪的精细动作，三项满分为21分。实验时保持房间内的安静，在自然光线下进行测试。将乳鼠放置于宽大活动场地，待其活动自如后开始评估，分别从不同方向对乳鼠进行评定。1.5.2 SOD活性和MDA含量的检测 以4 ml/kg剂量将10%的水合氯醛腹腔注射麻醉乳鼠，经腹主动脉采血，3 000 r/min离心10 min，取上清液，按试剂盒说明测定大鼠血清SOD活性和MDA的含量。

1.5.3 GAP-43和SYP 表达的检测 麻醉乳鼠经腹主动脉采血后，再经心脏灌注4% 的多聚甲醛，然后将其固定，开颅，暴露出大脑，取从前卤向后2 mm的冠状位脑片，用10%中性甲醛溶液固定24 h，常规处理后切片，SABC 法染色，进行GAP-43和SYP的免疫组化染色测定，具体操作步骤按照试剂盒上的说明进行。采用美国HMIAS-2000型图像分析系统测定平均光密度 (OD值) 。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组乳鼠不同时间的运动功能评分变化

与假手术组比较，模型组乳鼠运动功能评分明显降低(P<0.05)；经28 d针刺治疗，针刺组乳鼠的运动功能评分明显升高(P<0.05，表1)。说明针刺可以促进脑瘫乳鼠的运动功能的恢复。

Group14d28dS19.4±0.1919.3±0.17M6.9±0.18*7.4±0.16*A7.7±0.23*11.3±0.29*#

S： Sham operation group； M： Model group； A： Acupuncture group

*P<0.05vssham operation group;#P<0.05vsmodel group

2.2 各组乳鼠不同时间血清SOD和MDA含量的变化

与假手术组比较，乳鼠模型组血清SOD活性显著性降低(P<0.01)，MDA含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，针刺组SOD活性显著性增加(P<0.05，P<0.01)，MDA含量显著降低(P<0.01，表2)。

GroupSOD(U/ml)MDA(nmol/ml)14d28d14d28dS154.5±12.90157.9±15.33.50±0.493.62±0.56M116.5±13.76**129.4±10.4**10.46±1.77**9.83±1.43**A136.4±13.96**147.1±12.7##7.72±0.89**##6.48±1.26**##

S： Sham operation group； M： Model group； A： Acupuncture group； SOD： Superoxide dismutase； MDA： Malondialdehyde

**P<0.01vssham operation group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.3 各组乳鼠不同时间大脑病变区SYP和GAP-43表达的变化

与假手术组比较，模型组SYP 14 d的表达显著降低(P<0.05)，针刺组SYP 14 d的表达无显著差异(P<0.05)，模型组和针刺组乳鼠GAP-43的表达明显升高(P<0.05，P<0.01)。

GroupSYPGAP-4314d28d14d28dS0.162±0.0150.164±0.0130.090±0.0240.092±0.028M0.140±0.023*0.228±0.019*0.179±0.016*0.211±0.042*A0.152±0.0200.262±0.028**#0.182±0.024**0.288±0.025**#

S： Sham operation group； M： Model group； A： Acupuncture group； SYP： Synaptophysin； GAP-43： Growth associated protein 43

*P<0.05，**P<0.01vssham operation group;#P<0.05vsmodel group

3 讨论

小儿脑性瘫痪是指从出生前到出生后l个月内由各种原因所引起的脑损伤或发育缺陷所导致的运动障碍及姿势异常[5]。早产、产伤、围产期窒息及核黄疽等造成的新生儿脑组织缺血缺氧均是引起小儿脑性瘫痪的原因。临床表现主要有中枢性运动障碍及姿势异常，同时伴有不同程度的智力障碍、癫痫及视觉障碍、听觉障碍、语言行为障碍等。患儿将会长期或终生残疾，直接影响儿童的身心健康和人口素质的提高。目前，人们一直在积极探索脑瘫的有效治疗方法。有关文献表明，传统的针灸疗法已被证实有良好疗效，但文献只是单纯为了证实其疗效，而对其作用机制的研究相对较少。

正常机体存在抗氧化和氧化系统，两系统互相制约而保持着动态平衡。脑组织在缺血缺氧状态下，机体将会产生大量自由基，使过氧化产物蓄积，引起脑组织损伤。MDA是氧化反应的最终产物，可以作为过氧化产物的标志物[6，7]。SOD是机体中主要的抗氧化酶，其活性代表着组织清除体内自由基的能力。SOD可以催化氧自由基的歧化反应，使之转化为氧气和过氧化氢，从而降低过氧化损伤，调节机体抗氧化和氧化体系的平衡[8]。本实验结果表明脑瘫乳鼠经过针刺治疗能够使SOD的含量升高、使MDA的含量降低，改善脑缺血缺氧引起的脑损伤。

多数脑瘫是多部位的脑组织缺血缺氧，其神经元的损伤不容忽视，神经元可以通过重塑和功能重组来修复。大脑可塑性包括现有突触功能的变化、突触发生、皮质重组和可能的神经再生。SYP是一种分布于突触囊泡膜上且与突触结构和功能密切相关的特异性糖蛋白。它既可作为突触发生的标志，又能反映出突触的密度和传递效能，与递质的释放关系密切，可影响突触可塑性[9]。SYP在突触形成的起始阶段、突触结构的保持以及突触传递过程中都是必需的，是突触重建的重要标志。SYP的免疫组化结果可准确反映神经突触的密度，模型组乳鼠脑缺血缺氧损伤后，大量的神经细胞死亡或凋亡，突触结构崩溃，病变脑区神经元发生病变，导致神经突触末梢的蜕变甚至丢失，同时神经细胞的代谢减弱、蛋白的合成能力下降，轴浆运输功能随之下降，所以模型组SYP的表达首先是降低的；其后，自然修复和突触代偿功能促进神经细胞再生、突触重建，SYP的表达能力明显增高，这与国外文献报道的基本一致[10]。SYP表达能力的提高可以反映神经传递的增加，这种神经传递的增加在一定程度上也能改善认知与肢体活动功能[11]。

GAP-43是一种与神经轴突生长密切相关的神经组织特异性磷酸蛋白，在神经生长部位的表达较为丰富，在神经细胞、雪旺细胞和神经胶质细胞中分布较为广泛，它能够促进神经元发育，是神经细胞的生长、再生及突触形成和重建的标志性物质[12]，是神经元再塑性的一项重要的观察指标。GAP-43与神经细胞发育、突触的可塑性、神经再生等密切相关[13]。模型组乳鼠缺血缺氧，神经细胞受到损伤时，可以通过突触、轴突的再生，使受损的神经元重新建立联系进行代偿，神经可塑性增加[14]。GAP-43呈高水平表达提示神经纤维正处于再生活跃状态，神经元突触、轴突再生增强。

本研究结果显示，针刺组治疗28 d时SYP和GAP-43的表达较模型组显著性升高，说明针刺可以通过上调受损脑组织SYP和GAP-43的表达，并延长其高表达时程，来改善脑组织缺血缺氧损伤后神经细胞的轴突再生和突触的重塑，促进损伤神经细胞的修复。

针刺穴位治疗脑瘫，把中医的经络学说和现代医学的大脑功能定位相结合，在脑康复医学中具有独特的意义。通过针刺相关穴位，可以促进脑组织病变区侧枝循环的形成，可解除血管痉挛，改善脑组织供血，同时激活抑制状态的脑细胞，增强机体免疫力，有助于疾病的恢复。脑瘫运动功能障碍属祖国中医学“痿证”范畴，针刺治疗以选阳明经脉腧穴为主。另外，针刺经穴，可以疏通经脉，上达巅顶，直接刺激大脑皮质网络系统，从而改善患肢的运动功能。本研究认为针刺疗法可以通过提高SOD的活性和降低MDA的含量来抑制氧化损伤，可以促进大脑组织的GAP-43和SYP的表达，来完成脑组织的重塑与功能重组，从而促进脑瘫乳鼠运动功能的恢复。

近年来, 中医针灸治疗脑瘫越来越被医学界所重视, 尤其是针灸表现出来的独特疗效,已经被广大患者所选择。针灸治疗脑瘫将有广阔的研究前景，临床观察结果[15]提示，脑瘫患儿越早治疗越好。中枢神经系统尚未发育成熟时，其可塑性及代偿功能均较强，可通过穴位刺激疗法促进轴突的发育，故治疗效果较好；脑瘫患儿随着年龄的增长，伴随的临床症状越来越明显，异常身体姿势固定化，引起继发性肌肉萎缩、肌腱挛缩、肌张力降低、功能障碍等临床症状，治疗可逆性差，疗效相对较差。故对脑瘫患儿应当早诊断、早治疗。本研究为针刺治疗小儿脑瘫提供了理论依据和支持，为今后脑瘫治疗研究提供了基础。

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Therapeutic effect of acupuncture treatment on ischemic hypoxic neonate rats with cerebral palsy

LI Su-hui1, SUN Hong-tao2△, WANG Yan-min2, WEI Zheng-jun2

(1. Department of Instrument and Equipmement, 2. Department of Neurology, Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People's Armed Police Forces, Tianjin 300162, China)

Objective: To explore the mechanisms of acupuncture treatment promoting the motor function recovery of neonate rats with cerebral palsy. Methods: The improved hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) means was performed to establish the model of neonate rats with cerebral palsy. All neonate rats were randomly divided into 3 groups: sham group, model group and acupuncture group (n=20). We observed and scored motor function of rats, measured the levels of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in serum, and also measured the expression of synaptophysin(SYP) and growth associated protein-43(GAP-43) in the diseased region of cerebral tissue. Results: The motor function scores (11.3±0.29) and the serum level of SOD (147.1±12.7) U/ml in acupuncture treatment group were higher than those of model group (P<0.05). The serum level of MDA was lower in acupuncture treatment group than that of model group (P<0.05). The expression of SYP and GAP-43 in the diseased region of cerebral tissue of acupuncture treatment group were higher than those of model group (P<0.05). Conclusion: Acupuncture-therapy could improve the motor function of neonate rats with cerebral palsy by decreasing the content of MDA in serum, increasing the contents of SOD in serum， and prolonging the upregulation of SYP and GAP-43 expressions in brain tissue.

acupuncture therapy; cerebral palsy; growth associated protein; synaptophysin; neonate rat

2014-11-05

2015-06-03

R245.3

A

1000-6834(2015)05-473-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.023

△【通讯作者】Tel: 022-60577145; E-mail: chenmo333@163.com