血浆和组织miR-124表达与大肠癌患者预后的相关性分析

吕梅，宦欣，李芊蔚，王砚砚

论著·临床

血浆和组织miR-124表达与大肠癌患者预后的相关性分析

吕梅，宦欣，李芊蔚，王砚砚

目的 分析血浆和组织中miR-124表达水平与大肠癌患者预后的相关性。方法 收集大肠癌患者71例，其中无法切除患者49例、完全切除患者22例，收集其血浆和肿瘤组织样本。检测肿瘤无法切除患者血浆和组织中miR-101、miR-124、miR-126、miR-210、miR-217的表达，通过实时定量反转录聚合酶链反应 (qRT-PCR)分析miR-124表达和患者及无进展生存期(PFS)的相关性。结果 qRT-PCR检测无法切除大肠癌患者血浆和组织中miRNAs表达，其中高表达的miR-124变化最显著(分别为P<0.05，P<0.01)，其他miRNAs无明显变化。血浆中miR-124与患者OS相关：在无法切除大肠癌患者血浆、组织中高表达miR-124与OS呈正相关(血浆:OR=0.451, 95% CI 0.189～0.654,P=0.002；组织：OR=0.295, 95% CI 0.493～1.374,P=0.037)。Cox比例风险模型评估：采用Cox比例风险模型评估发现血浆中高表达miR-124与PFS相关(OR=0.147，P=0.022)；而组织中高表达miR-124与PFS无相关性(OR=0.281，P=0.057)，血浆和组织中低表达miR-124与低死亡风险比无相关性(OR=2.07，P=0.163)。高miR-124表达同PFS无相关性(OR=1.85，P=0.725)。结论 血浆中miR-124表达可以作为评价大肠癌预后的生物标记物。

大肠癌；miR-124；总生存期;相关性

大肠癌是世界范围内病死率最高的疾病之一。尽管随着科学技术发展，早期诊断和先进的治疗方法不断应用到临床治疗上，但是许多大肠癌患者仍然是不能治愈的[1，2]。microRNAs(miRNAs)是一类由20～25个核苷酸组成的内源性非编码单链小RNA分子，其典型特征是具有发卡结构。miRNAs家族一般通过与特定mRNA 3’UTR(3’-untranslated regions)的不完全或完全互补结合，抑制靶mRNA的翻译或促使其降解，调节基因的表达，进而参与细胞增殖、分化、凋亡、代谢、激素分泌及个体发育等几乎所有已知的生物学过程[3，4]，因而，miRNAs在肿瘤中既可以促进癌细胞的生长，也可以抑制癌细胞的生长。体液中能检测到miRNAs，包括血清、血浆、唾液等。虽然miRNAs是不稳定的RNA分子，但是血液中miRNAs相对比较稳定而且在血液中容易检测[5，6]。研究发现，miRNAs在大肠癌的发生、发展、侵袭和转移中发挥重要作用[7]。随着分子生物学技术的发展，癌症相关miRNAs被陆续发现。现评价miR-124与大肠癌患者预后的相关性，有助于了解大肠癌发生发展的分子调控网络。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012年9月—2014年7月我院治疗大肠癌患者71例。诊断标准：(1)粪便隐血试验阳性；(2)结肠镜检查及病理活检确诊；(3)X线钡剂灌肠显示大肠损伤[8]。所有患者无既往治疗史，均接受常规的化学治疗。有家族遗传史15例，合并高血压、糖尿病等其他疾病39例。71例患者中包括49例无法手术切除患者和22例肿瘤完全切除患者。大肠癌TNM分期中，无法切除患者49例均为IV期，且已有远处淋巴结转移管状腺癌44例；而完全切除患者22例中16例为II或III期，管状腺癌19例。二者比较，差异有统计学意义(P<0.01)。其中性别、年龄、原发部位、组织学类型比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。本试验得到了我院伦理委员会批准，所有参加研究的大肠癌患者均签署知情同意书。

表1 71例患者基线资料比较 (例)

1.2 标本收集 血液标本收集到EDTA管中，分离血浆贮存在-80°C。从病理科获得所有患者福尔马林固定石蜡包埋组织标本。

1.3 RNA提取 总RNA从血浆和组织标本中提取，采用mirVanaTM miRNA Isolation Kit(北京美科美生物技术开发有限公司)进行，方法如下：研磨的组织样品30～100 mg或者血液200 μl,加300～1 000 μl裂解液，充分涡旋，置于冰上；加30～100 μl Homogenate Additive(上海康成生物工程有限公司)，充分涡旋，置冰上10 min；加300～1 000 μl酸性苯酚，涡旋30～60 min；10 000 g离心5 min。小心取出上层水样，放入新的EP管，标注移出液体的体积；加1.25倍体积(上层水样体积)的乙醇，充分混匀；Wash buffer 1洗2次，Wash buffer 2洗1次，离心，弃滤液；滤筒入新的收集管，加100 μl预热洗脱液，离心20～30 s，收集的滤液放-80℃保存。

1.4 实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR) 20 μl反转录体系包括：含20～25 ng RNA样品14 μl，4 μl 5×反应buffer，2 μl 混合酶(上海康成生物工程有限公司)，在42℃水浴中反应60 min，然后在95℃水浴中灭活反转录反应5 min。通过Mx3000PTM仪器(Agilent公司,美国)进行实时定量RT-PCR扩增，每个反应包括10 μl SYBR_ Green混合酶，LNA×miRNAs 引物混合物(上海康成生物工程有限公司)2 μl，稀释的cDNA样品2 μl，聚合酶激活/变性(95℃10 min)，40扩增循环(95℃10 s和60℃ 60 s)。

应用分析软件以U6 RNA作为内参照；通过检测基因的Ct减去内参U6 Ct得到每组的Ct，参照文献[9]报道的方法，计算基因相对的表达。

1.5 观测项目 应用qRT-PCR检测无法切除患者血浆和组织中miR-101、miR-124、miR-126、miR-210、miR-217；分析血浆中miR-124与患者OS、低风险比相关性。

2 结 果

2.1 miRNAs检测 qRT-PCR检测无法切除大肠癌患者血浆和组织中miRNAs表达，其中高表达的miR-124变化最显著(分别为P<0.05，P<0.01)，其他miRNAs无明显变化(P>0.05)，见表2。

表2 49例大肠癌无法切除患者血浆和组织中miRNAs表达

注：与低表达组比较，aP<0.05，bP<0.01

2.2 相关分析 (1)血浆中miR-124与患者OS相关性：在无法切除大肠癌患者血浆、组织中高表达miR-124与OS呈正相关性(血浆:OR=0.451, 95% CI 0.189～0.654,P=0.002；组织：OR=0.295, 95% CI 0.493～1.374,P=0.037)(图1，2)。(2) Cox比例风险模型评估：采用Cox比例风险模型评估发现血浆中高表达miR-124与PFS相关(OR=0.147，P=0.022)；而组织中高表达miR-124与PFS比无相关性(OR=0.281，P=0.057)(表3)，血浆和组织中低表达miR-124与低死亡风险无相关性(OR=2.07，P=0.163)；高miR-124表达同PFS无相关性(OR=1.85，P=0.725)。

图1 无法切除大肠癌患者血浆中高表达miR-124和低表达miR-124与总体生存期相关性

图2 无法切除大肠癌患者组织中高表达miR-124和低表达miR-124与总体生存期相关性

3 讨 论

大肠癌是一个多基因、多阶段形成的复杂病变过程。如果能够早期诊断以及监测肿瘤的复发，就可以采取有效治疗，对大肠癌预防有重大意义。近年来已发现许多miRNAs存在于大肠癌患者肿瘤组织和血液中[9，10]。miRNAs的表达和处理方式在人类恶性肿瘤表现出多方面变化，通过靶向作用于数百个靶蛋白，在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要调节作用[11]。这为提高大肠癌早期筛查、诊断和治疗及预后的判断提供了一个全新的视角。

表3 大肠癌患者血浆和组织中miR-124与生存期的关系

最近，许多基因芯片用于检测大肠癌组织中miRNAs的表达变化情况。Diosdado等[12]使用qRT-PCR测定55例大肠癌患者和10例健康对照者组织中miR-17～92簇的表达水平及48例肿瘤组织中c-Myc mRNA的表达水平，结果发现除了miR-18a外，其他检测miRNAs均在大肠癌组织中表达增加，c-Myc和miR-17 -92簇表达明显呈正相关。在本研究中，我们通过qRT-PCR检测患者血浆和组织中miR-101、miR-124、miR-126、miR-210、miR-217表达变化，这些miRNAs与大肠癌的发病机制间关系未见相关报道。以往也有一些报道miRNAs从癌细胞释放到血液中。研究表明肿瘤源性miRNAs可以非常稳定地存在于人类血液中(内受内源性核糖核酸酶的保护)，且其表达水平临床能够检测到，另外循环miRNAs与原发肿瘤生物学有潜在联系[5]。目前已经证实大肠癌中循环miRNAs表达失调，可能作为大肠癌早期诊断的标志物[13]。Huang等[14]使用qRT-PCR检测晚期大肠肿瘤患者及健康对照者血清中12个miRNAs的表达水平，发现血清中miR-92a和miR-29a对晚期肿瘤具有重要的诊断价值。两者在鉴别大肠癌和正常对照组时受试者工作特征曲线下面积分别为0.844和0.838，在早期诊断大肠癌时具有巨大的潜力。

关于miR-124在肿瘤中的作用，已有一些相关报道，如miR-124在胃癌组织中表达减少，在细胞水平上证实miR-124抵制胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭等[15～17]。Anwar等[18]报道miR-124在非甲基化肝细胞癌中的表达高于甲基化标本。Wang等[19]发现miR-124下调与大肠癌患者预后差相关。在本研究中，患者血浆和组织中高表达miR-124与大肠癌患者预后有相关性，进一步采用Cox比例风险模型评估血浆中高表达miR-124与低死亡风险相关，而组织中高表达miR-124与低死亡风险无相关性。血浆中miR-124表达评价大肠癌预后更为准确。

本研究具有一定的局限性：(1)研究对象样本量较少，71例大肠癌患者中无法手术切除患者只有49例，下一步研究需要增大样本例数；(2)本研究只选择无法手术切除患者作为研究对象，而手术切除肿瘤患者血清和组织中miR-124表达以及与大肠癌患者预后关系也要进一步研究；(3)miR-124在大肠癌中发挥作用的机制也不清楚，包括其作用的靶蛋白，其靶蛋白在组织和血液中的表达等。

总之，本研究发现大肠癌患者血浆和组织中miR-124表达增加，而且血浆中miR-124表达与大肠癌患者预后具有相关性。但目前的研究仍处于起始阶段，miR-124功能仍需深入研究，才有可能应用到临床上。

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Expression levels of microRNA-124 in plasma and tissure correlated with prognosis in patients with colorectal cancer

LVMei,HUANXin,LIQianwei,WANGYanyan.DepartmentofGastroenterology,ZhongshanAffiliatedHospitalofDalianUniversity,LiaoningProvince,Dalian116001,China

Objective To analyze the correlation between plasma and tissue miR-124 expression and overall survival(OS) of patients with colorectal cancer.Methods Collected 71 cases of patients with colorectal cancer which cannot be removed (n=49), completely resected (n=22), collected the plasma and tumor tissue samples. Detected tumor unresectable tissue and plasma of miR-101, miR-124, miR-126, miR-210, miR-217’s expression, by quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) to analyze the correlation between miR-124 expression and the prognosis of the patients.Results qRT-PCR for detection of unresectable expression of miRNAs in plasma and tissue in patients with colorectal cancer, high expression of miR-124’s changes revealed as the most significant (P<0.05,P<0.01), and other miRNAs did not show significant changes. (1) Correlation between plasma miR-124 and patients’ OS: in unresectable colorectal cancer patients, plasma and tissue expression of miR-124 was positively correlated with the OS (OR=0.451, 95% CI 0.189 - 0.654,P=0.002;OR=0.295, 95% CI 0.493-13.74,P=0.037). (2) Cox proportional hazards models assessment: the Cox proportional hazards model evaluation revealed that the high expression of miR-124 in plasma were correlated with PFS (OR=0.147,P=0.022); and high expression of miR-124 in tissue had no correlation with PFS (OR=0.281,P=0.057), plasma and tissue low expression of miR-124 had no correlation with low mortality risk ratio (OR=2.07,P=0.163).High expression of miR-124 had no correlation with PFS (OR=1.85,P=0.725).Conclusion It demonstrated that the plasma miR-124 expressions could be used as biological markers for evaluating the prognosis of colorectal cancer.

Colorectal carcinoma; microRNA-124; Overall survival; Correlation

116001 大连大学附属中山医院消化内科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.11.008

2015-03-04)