蜂胶的指纹图谱研究

张红梅 文 萍 范婷婷 吕武清* 姚剑平 胡棠洪 俞建辉 李淑岚

（1 江西省中医药研究院，江西 南昌 330046；2 江西中医药大学，江西 南昌 330004；3 江西省保健品协会，江西 南昌 330046；4 江西汪氏蜜蜂园有限公司，江西 南昌 330100）

蜂胶是蜜蜂采集植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的胶黏性物质。由于不同地区植被种类以及植物的分泌物不同，导致其化学成分的复杂性。已知成分有黄酮类、萜烯类、绿原酸等有机酸、芳香性醛类、醇类、酚类、酶、氨基酸、维生素B族、矿物质和微量元素等[1-2]。蜂胶化学成分的复杂性，决定了蜂胶药理活性的多样性。现代药理作用研究发现，蜂胶药理活性非常广泛，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、调节血糖、调节机体免疫功能、促进组织细胞再生等多种生物活性[3-4]。目前，蜂胶已经被加工成各种剂型，广泛应用于食品，药品和化妆品。但蜂胶来源复杂，以国产蜂胶为主，有部分巴西、乌拉圭进口蜂胶，由于需求量大，制假现象十分严重，通常以杨树芽提取物仿冒蜂胶提取物。针对蜂胶质量控制存在的问题，本课题组从蜂胶提取物制备工艺[5]、总黄酮测定方法[6-7]及松属素、白杨素、高良姜素HPLC测定等方面进行研究[8]，本文研究建立了国产蜂胶HPLC指纹图谱，为蜂胶的质量控制提供了科学依据。

1 仪器、试药与材料

1.1 仪器：Waters 1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司，包括：2487紫外检测器，2707自动进样器，Empower-2色谱工作站）；CQ-250超声波清洗器（上海船舶电子设备研究所）；SimplicityTM型超纯水系统（美国Millipore公司）；MettllerTkledoAG135双量程电子天平（十万分之一）。

1.2 试样：对照品：白杨素对照品（批号111701-200501），高良姜素对照品（批号111699-200501），乔松素对照品（批号100080-200707），蜂胶对照药材（批号121324-200301），对照品均由中国药品生物制品检定所提供。所用试剂甲醇为色谱纯，其他均为分析纯。样品：蜂胶为课题组收集云南（样品编号16、17）、四川（编号35、37、38）、江西（编号90、99、103，104，106）、湖南（编号111，117，119）、山东（编号128、129）、河南（编号27、43，45，47）、山西（编号50、52、57）、内蒙（编号130、134、136）、辽宁（编号138）、陕西（编号2、4）、甘肃（编号10、15）、新疆（编号31）、浙江（编号86、87、88、89）等地，经江西省中医药研究院副研究员余良忠鉴定为蜜蜂采集植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的胶黏性物质。杨树胶：58、59、62、63、64、65、66、153～159（购于河南）。

2 方法和结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备：取蜂胶样品粉末（52号）约60 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入甲醇30 mL，超声处理30 min，放冷，再用甲醇定容至刻度，摇匀。

2.1.2 对照品溶液的制备：分别取白杨素、乔松素、高良姜素对照品各适量，精密称定，加甲醇使溶解并稀释，摇匀，分别制成每毫升含乔松素8.523 μg，高良姜素34.576 μg，白杨素18.36 μg。

2.2 色谱条件：色谱柱为YMCC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A：甲醇-B：0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～20 min由30%A升至45%A，20～50 min由45%A升至55%A，50～90 min维持55%A；柱温：35 ℃；检测波长：285 nm；进样量：10 µL。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度考察：取蜂胶样品，按2.1.1项制备方法制成供试品溶液，连续进样6次，测定，采用国家药典委员会推荐用的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版计算得到相似度。结果表明：各色谱峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于1%，相似度大于0.98，仪器精密度较好。

2.3.2 稳定性考察：取上述供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算10个主要色谱峰面积并计算相似度。结果表明：各色谱峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均<2%，相似度>0.99，说明样品在24 h内稳定。

2.3.3 重复性考察：取同一批蜂胶样品6份，按照2.1.1项制备方法制备供试品溶液，进样测定，结果表明：各色谱峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均<1%，相似度在0.99以上，表明本测定方法重复性较好。

2.4 蜂胶对照指纹图谱的建立：取10批蜂胶按2.1.1制备方法制成供试品溶液，进样测定，记录色谱图。分别在waters色谱工作站设定积分参数，进行积分，逐个以cdf数据文件的形式，导出谱图的AIA文件，再分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版（国家药典委员会）。对其中10个主要色谱峰进行色谱峰匹配，结果见图1，采用自动匹配生成对照指纹图谱见图2。

2.5 蜂胶指纹图谱相似度测定：取以下蜂胶样品按2.1.1项制备方法制成供试品溶液，进样测定，所得的AIA色谱图文件与蜂胶对照指纹图谱分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年B版（国家药典委员会），进行多点校正，并计算相似度，蜂胶相似度计算结果见表1。

图1 10批蜂胶供试品色谱图匹配结果(t/min)

图2 蜂胶对照指纹图谱（t/min）

图3 13批杨树胶的色谱图匹配结果(t/min)

表1 蜂胶相似度计算结果

经计算机相似度计算，35批蜂胶供试品色谱图与蜂胶对照指纹图谱进行比较，相似度结果均>0.9，目前的数据说明蜂胶批与批之间有较好的均一性。

2.6 杨树胶HPLC指纹图谱研究：取不同批次的杨树胶按2.1.1项制备方法制成供试品溶液，进样测定，记录色谱图，导出图谱如图3所示。结果表明：杨树胶均无1、2号共有峰，多数样品无9号共有峰。

3 讨 论

3.1 本实验对色谱条件的确定进行了优化选择，通过对不同流动相、色谱柱、柱温和检测波长比较，优化了色谱条件，确定了梯度洗脱比例，达到了有效分离，色谱信息量大，主要色谱峰分离度均＞1.5，通过耐用性试验证明该方法稳定性，重现性好，可用来评价蜂胶的质量。

3.2 蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂，混入其分泌物加工而成的一种物质。研究结果表明，我国蜂胶以采集杨树树脂为主，蜂胶指纹图谱与杨树胶基本相同，由于蜂胶混入了蜂蜜的分泌物，在分泌物中酶等作用下，蜂胶指纹图谱与杨树胶又有差别，特别是杨树胶不具备蜂胶指纹图谱中的1、2、9号色谱蜂。因此，指纹图谱对鉴别蜂胶和杨树胶具有重要意义。

3.3 不同地域植物差异较大，蜂胶采集其树脂分泌物得到的蜂胶差异也大，指纹图谱研究结果显示，巴西蜂胶与我国蜂胶指纹图谱完全不同，共有蜂及共有峰峰面积差异较大，证明了巴西蜂胶植物来源与国产蜂胶存在较大差异[9]，而乌拉圭蜂胶指纹图谱与我国产蜂胶指纹图谱基本相同，与区域植物资源相关[10]。

3.4 指纹图谱显示松属素（6号峰）、白杨素（8号峰）、高良姜素（10号峰）为蜂胶和杨树胶中主要化合物，杨树胶几乎无1、2号峰化合物或9号峰化合物，而巴西蜂胶主要成分在前端2、3号峰。因此，指纹图谱对蜂胶的真伪、来源鉴别具有重要意义，但对蜂胶掺假及不合格蜂胶的鉴别有待于进一步研究。

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[2] 杨琴,朱美玲.蜂胶提取物及蜂胶保健食品的质量标准探讨及质量安全控制[J].蜜蜂杂志,2008,28(1):10-14.

[3] 蒋春红,吕武清.蜂胶的药理作用研究概况[J].中国医药指南,2011,9(17):42-43.

[4] 朱磊,李君.蜂胶的药理作用研究[J].中国当代医药,2012,19(22):24-25.

[5] 吕武清,文萍.蜂胶提取物制备工艺研究[J].中草药,2014,45(6):791-794.

[6] 姚剑平,文萍.蜂胶提取物总黄酮含量测定方法研究[J].中华中医药学刊,2013,31(11):2414-2416.

[7] 范婷婷,文萍.蜂胶总共同酮含量测定方法的探讨[J].中国医药指南,2013,11(13):63-64.

[8] 文萍,范婷婷.RP-HPLC测定蜂胶中乔松素、白杨素和高良姜素的含量[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(19):108-110.

[9] 周梦遥,徐瑞晗.世界主要蜂胶的植物源及多酚类化合物的研究进展[J].中国蜂业,2010,61(3):5-10.

[10] 王想想,周立东.蜂胶与其胶源植物的化学成分相关性研究综述[J].中药材,2007,30(4):487-492.