壳聚糖絮凝法精制川牛膝总多糖酶提取液的工艺研究

成 悦 刘傲霞 夏玉婷 谷旭晗 韩 伟

（华东理工大学中药现代化工程中心，上海200237）

壳聚糖絮凝法精制川牛膝总多糖酶提取液的工艺研究

成 悦 刘傲霞 夏玉婷 谷旭晗 韩 伟

（华东理工大学中药现代化工程中心，上海200237）

以壳聚糖为絮凝剂对川牛膝的总多糖进行了絮凝纯化研究。通过单因素考察及正交试验得到优化的工艺条件为：絮凝温度45℃、壳聚糖用量0.4 mL/g生药量、絮凝时间2 h、药液浓缩比1∶12、药液pH＝4。此时，多糖保留率76.32%、脱蛋白率64.25%，与传统醇沉工艺相比，絮凝法得到的多糖保留率和纯度较高。

壳聚糖；絮凝；川牛膝；总多糖；试剂

0 引言

川牛膝为苋科植物川牛膝（Cyathula officinaIis Kuan）的干燥根，为著名川产药材，具有补肝肾、强筋骨、治疗腰膝酸麻及肝阳眩晕、散癖血、消肿痛等功效。川牛膝多糖是从川牛膝根中提取的一种生物活性多糖，相对分子质量1 000～2 200，是高度分支的果聚糖。现代药理研究表明，川牛膝多糖具有促进红细胞免疫、抗肿瘤、对抗环磷酰胺所致外周白细胞减少等疗效。

絮凝技术是一种简单有效的固液两相体系分离方法，壳聚糖作为一种天然的链状高分子絮凝剂，由葡萄糖胺通过β-1，4-糖苷键连接而成。由于分子中含有氨基，使壳聚糖在酸性条件下带有正电荷，可发挥电中和与吸附架桥的双重絮凝作用，并具有安全、无毒、稳定的优点。

本文以多糖保留率和脱蛋白率为指标，考察壳聚糖对川牛膝总多糖酶提取液的絮凝纯化工艺，并通过数据分析优化工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 药材

川牛膝，产地为四川，购于上海雷允上药店。将川牛膝粉碎过筛成干粉后进行预处理：用10倍量的体积分数95%的工业乙醇回流1 h，冷却至室温，取上清液回收乙醇，烘干药渣，装袋于阴凉处储存备用。

1.1.2 主要试剂

纤维素酶，上海楷洋生物技术有限公司；95%工业乙醇；36%浓盐酸、氢氧化钠、5%苯酚溶液、98%浓硫酸等均为国产分析纯；葡萄糖为标准品（＞95%），上海凌峰化学试剂有限公司；牛血清白蛋白和考马斯亮蓝G-250均为分析纯，上海源聚生物科技有限公司；壳聚糖，上海伟康生物制品有限公司。

1.1.3 主要仪器

UV1900PC紫外可见分光光度计，上海亚研电子科技有限公司；pHS-2C数字式pH计，上海雷磁仪器厂；AL204分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水真空泵，巩义市英峪予华仪器厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市英峪予华仪器厂；RE-52C旋转蒸发器，上海予华仪器有限公司；RJ-TGL-16C台式高速离心机，无锡市瑞江分机仪器有限公司。

1.2 样品及试剂的制备

1.2.1 样品溶液的制备

（1）药材的预处理：将川牛膝粉碎过筛成干粉后进行预处理，用10倍量的体积分数95%的工业乙醇回流1 h，冷却至室温，回收乙醇，烘干药渣，装袋于阴凉处储存备用。

（2）样品溶液的制备：称取20 g已处理的药材和60 mg纤维素酶，置于500 mL的圆底烧瓶中；加入400 mL pH＝5的去离子水，在45℃恒温水浴锅中酶解提取30 min，再用电热套冷凝回流30 min，室温冷却15 min后，放入冷水中冷却（敞口）；冷却至室温后抽滤，收集滤液并量取其体积。

1.2.2 试剂的制备

（1）葡萄糖标准溶液的制备：精确称取105℃干燥至恒质量的葡萄糖50 mg，加去离子水溶解并定容至500 mL，即得0.10 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

（2）质量分数5%苯酚溶液的制备：称取精制苯酚2.50 g，加去离子水溶液并定容至50 mL棕色容量瓶，配制成质量分数5%的苯酚溶液。

（3）蛋白质标准溶液的制备：准确称取20 mg结晶牛血清白蛋白，加水溶解，转移至100 mL容量瓶中，定容，配制成0.20 mg/mL的蛋白质标准溶液。

（4）考马斯亮蓝G-250试剂的制备：准确称取50 mg的考马斯亮蓝G-250，将其溶解于25 mL 95%的乙醇，再加入50mL85%的磷酸，加水定容至500mL。

（5）壳聚糖絮凝剂的制备：取10 g醋酸（ρ=1.050，约为9.5 mL）置于600 mL大烧杯中，加入适量去离子水稀释；准确称取10.0 g壳聚糖，分批多次加入大烧杯中，搅拌至完全溶解，转移至1 000 mL容量瓶，补充去离子水定容，即配制成1%的壳聚糖醋酸溶液，将其放置于冰箱内2～3天充分溶胀后备用。

1.3 分析方法的建立及计算

1.3.1 川牛膝总多糖含量的测定

精密吸取葡萄糖标准溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL，分别置于25 mL具塞比色管中，补充去离子水至2.0 mL。加入质量分数5%的苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入质量分数98%的H2SO45.0 mL，摇匀，室温静置30 min。用紫外可见分光光度计分别在489 nm波长处测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标、葡萄糖浓度C（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A＝12.040 48C－0.024 32，相关系数R＝0.999 22。

准确移取2 mL样品溶液，按相同的显色操作，测定吸光度，根据回归方程计算样品溶液中总多糖的浓度及多糖保留率。

1.3.2 蛋白质含量的测定

分别称取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的蛋白质标准溶液置于25 mL具塞比色管中，均补充去离子水至1.0 mL，各加入考马斯亮蓝试剂5.0 mL，立即摇匀，室温下静置5 min，以1 mL去离子水作空白对照，于595 nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、标准品浓度C（mg/mL）为横坐标，绘制蛋白质标准曲线，得回归方程为：A＝5.680 8C－0.058 7，相关系数R=0.999 32。

取样品溶液1.0 mL，按相同的显色操作，测定吸光度，根据回归方程计算样品中的蛋白质的含量及脱蛋白率。

1.4 实验方法

移取一定浓缩比的药液20 mL，在电磁搅拌状态下，缓慢加入一定量的壳聚糖1%的醋酸溶液，水浴保温搅拌一定时间后取出，离心分离，取上清液测定多糖和蛋白质的含量。

2 结果与分析

2.1 絮凝时间对絮凝纯化结果的影响

图1为絮凝时间对絮凝纯化结果的影响。可以看出，多糖保留率随时间的增加而降低，在1.5～2 h范围内下降迅速，超过2 h后趋于稳定；而脱蛋白率随着时间的增加逐渐增大，并趋于稳定，但絮凝时间过长对提高絮凝效果的作用不大，且多糖的损失会增加。

图1 絮凝时间对絮凝纯化结果的影响

综上，絮凝时间选取1.5 h为宜。

2.2 浓缩比对絮凝纯化结果的影响

药液浓缩比对絮凝纯化结果的影响如图2所示，可以看出，多糖保留率和脱蛋白率均随着浓缩比的增大而增大，在稀释到1∶10（g/mL）后，两者均有下降趋势，且脱蛋白率的下降趋势更为明显。

图2 药液浓缩比对絮凝纯化结果的影响

产生这一现象的原因是，当浓缩比合适时，药液能与絮凝剂充分结合，在分子间架桥并发挥絮凝作用。药液浓度过小，溶液黏度较大，胶粒间距较小，不利于壳聚糖高分子链的分散，多糖易被包裹沉淀，造成多糖损失较大；药液浓度过大，壳聚糖浓度降低，不利于絮凝剂分子与杂质微粒的充分接触，导致脱蛋白率降低。

综上，浓缩比选取1∶10为宜。

2.3 温度对絮凝纯化结果的影响

图3为絮凝温度对纯化结果的影响。可以发现，随着絮凝温度的增加，多糖保留率逐渐下降，而脱蛋白率先上升后下降，在温度为45℃时，脱蛋白率达到最高。这是因为温度升高，分子热运动较快，絮凝剂与杂质分子的碰撞几率增大，溶液在高温下黏度加大，胶体颗粒结合成的絮凝体也增大，因此加速了絮凝。但温度过高，易使絮凝剂分子老化，阻碍絮凝。

图3 絮凝温度对絮凝纯化结果的影响

综上，确定絮凝温度在45℃左右为宜。

2.4 壳聚糖用量对絮凝纯化结果的影响

壳聚糖用量对絮凝纯化结果的影响如图4所示。随着壳聚糖用量的增加，脱蛋白率增加，在0.8 mL/g后增加趋势减缓，多糖保留率逐渐下降。这是因为壳聚糖浓度较低时，絮凝剂分子与杂质微粒的碰撞几率小，进行电中和与吸附架桥的作用弱，不利于絮凝作用的发挥；随着壳聚糖用量增加，碰撞几率增大，除杂效果提升，但不利于架桥作用，使多糖保留率降低。

图4 壳聚糖用量对絮凝纯化结果的影响

综上，壳聚糖用量选取0.4 mL/g为宜。

2.5 溶液pH对絮凝纯化结果的影响

图5为pH值对絮凝纯化结果的影响。可以看出，随着药液pH的升高，多糖保留率迅速下降，在pH为6之后趋于平稳，而脱蛋白率先迅速上升，后逐渐下降，在pH为4时脱蛋白率最高。产生这一现象的原因是，壳聚糖具有电中和与吸附交联作用，当pH较低时，蛋白质为阳离子型，使壳聚糖电中和效果降低，脱蛋白率下降，同时多糖损失较多。当溶液pH较高时，体系中的负电荷增加，壳聚糖电中和负电荷增加，压缩双电层的效率降低，导致蛋白质去除率也下降。

图5 溶液pH值对絮凝纯化结果的影响

综上，选取溶液pH＝4为宜。

3 壳聚糖絮凝纯化正交试验

3.1 因素与水平的确定

根据单因素实验结果，选取对川牛膝多糖保留率及脱蛋白率影响较大的因素：壳聚糖用量（因素A）、浓缩比（因素B）、药液pH（因素C）、絮凝时间（因素D），设计L9（34）正交试验表，结果如表1所示。

表1 壳聚糖絮凝纯化L9（34）因素水平表

3.2 正交试验结果分析

现以多糖保留率、脱蛋白率为评价指标，根据L9（34）正交设计开展试验，实验结果与极差分析如表2所示，多糖保留率与脱蛋白率的方差分析分别如表3、表4所示。

由表2可知：

（1）以多糖保留率为评价指标，各因素对壳聚糖絮凝纯化工艺的影响大小依次为：A＞B＞D＞C，最佳工艺条为A1B3C1D2；表3的方差分析结果表明：壳聚糖用量、浓缩比、絮凝时间对多糖保留率均有显著影响。

（2）以脱蛋白率为评价指标，各因素对壳聚糖絮凝纯化工艺的影响大小依次为：A＞C＞D＞B，最佳工艺条件为A2B3C3D3；表4的方差分析结果表明：壳聚糖用量、药液pH、絮凝时间对脱蛋白率的影响显著。

综合上述分析结果，本研究主要根据脱蛋白率指标优选工艺条件，得到最佳工艺条件A2B3C3D3：壳聚糖用量0.4 mL/g生药量、浓缩比为1∶12、药液pH＝5、絮凝时间为120 min，此时多糖保留率为76.32%、脱蛋白率为64.25%。

表2 壳聚糖絮凝纯化实验结果与极差分析表

表4 脱蛋白率方差分析表

4 结语

（1）以多糖保留率和脱蛋白率为指标，在单因素实验的基础上，选择浓缩比、絮凝时间、壳聚糖用量、药液pH这4个因素进行L9（34）正交设计实验，确定最优的工艺条件为：壳聚糖用量0.4 mL/g生药量、浓缩比为1∶12、溶剂pH＝5、絮凝时间为120 min，此时，多糖保留率为76.32%，脱蛋白率为64.25%。

（2）利用统计学方法对正交实验结果进行显著性检验，确定各因素对多糖保留率影响大小的顺序为：壳聚糖用量＞浓缩比＞药液pH＞絮凝时间，其中壳聚糖用量、浓缩比、絮凝时间都为显著影响因素；确定各因素对脱蛋白率影响大小的顺序为：壳聚糖用量＞药液pH＞絮凝时间＞浓缩比，其中壳聚糖用量、药液pH、絮凝时间都为显著影响因素。

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Study on the Flocculating Purification Process of Total Polysaccharides from Cyathula Officinalis Kuan by Using Chitosan

Cheng Yue Liu Aoxia Xia Yuting Gu Xuhan Han Wei
（Engineering Center for Tradition Chinese Medicine Modernization,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237）

The essay was aimed at studying flocculating purification of total polysaccharides by using chitosan. The optimum conditions were obtained through single factor and orthogonal experiment.The results were as follows∶the temperature was 45℃,dosage of chitosan was 0.4 mL/g raw material,flocculation time was 2 h,solution concentration ratio was 1∶12,pH of solution was 4.Under this condition,polysaccharides retention rate was 76.32%, deproteinizing rate of 64.25%.Compared with the traditional alcohol precipitation process,the retention rate and purity of the polysaccharide of the flocculation purification process are higher.

chitosan;flocculate;Cyathula officinalis Kuan;total polysaccharide;reagent

2015-07-15

成悦（1992—），女，宁夏银川人，助理工程师，研究方向：制药工程与技术。

韩伟（1968—），男，江苏扬州人，博士，教授，从事中药制药工程、化工分离工程的研究工作。

国家大学生创新创业训练计划，项目编号：131025159；华东理工大学本科教育教学改革项目（2013年）