2种检测人肾综合征出血热IgG抗体ELISA试剂盒的比较

李卓，曾汉玉，马樱，刘媛，张戎，刘美宁，陈丽华

2种检测人肾综合征出血热IgG抗体ELISA试剂盒的比较

李卓，曾汉玉，马樱，刘媛，张戎，刘美宁，陈丽华

目的探讨国产与进口人肾综合征出血热（hemorrhagic feverwith renal syndrome,HFRS）IgG抗体ELISA检测试剂盒的性能差异。方法采用国产和进口ELISA试剂盒分别检测50例HFRS疫苗接种者血清样本中抗人HFRS IgG抗体含量，分析比较2种ELISA试剂盒的一致性、灵敏性、精密度以及方法学等的差异。结果2种ELISA试剂盒的精密度良好，批内变异系数均＜5%；2种试剂阳性一致率为100%，阴性一致率为20%，相似率为60%；灵敏性检测结果显示，2种ELISA试剂盒的灵敏性差异较大（P＜0.05），国产ELISA试剂盒的灵敏度约是进口ELISA试剂盒的5倍。结论国产人HFRSIgG抗体ELISA检测试剂盒灵敏性好，进口ELISA试剂盒特异性好，国产和进口ELISA试剂盒的精密度均良好，在实际应用中应根据具体情况合理选用。

汉坦病毒；肾综合征出血热；抗体；酶联免疫吸附测定

肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）是一种由汉坦病毒感染引起，以发热、出血和急性肾损伤为特征的急性传染病，90%以上病例发生在中国[1]，病死率为0.1%～10%[2]，是我国亟待控制的急性传染病之一。该病毒在我国流行的血清型主要是Ⅰ型［汉滩病毒（Hantaan virus, HTNV）］和Ⅱ型［汉城病毒（Seoul virus,SEOV）］[3-4]，分别是我国姬鼠型和家鼠型疫区的主要流行毒株[5]。此病是一种自然疫源性传染病，四季均可散发，每年11月至次年1月是其高发季节。我国对重点疫区的健康人群免费接种HFRS疫苗[6]，通常应用ELISA法检测HFRS抗体的产生情况来评价疫苗的接种效果[7]。ELISA法以其灵敏、特异、简便等特点已被广泛应用于各个领域[8-9]，但不同试剂盒的检测性能有所差异。本研究对国产和进口人HFRS抗体ELISA检测试剂盒的性能进行了比较，旨在为临床疾病的诊断和疫苗免疫效果的监测提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料50份血清样本来自陕西省乾县HFRS疫苗接种者。

1.2 主要试剂和仪器人HFRS抗体检测试剂盒（ELISA法）（以下简称国产ELISA试剂盒）由上海市西唐生物科技有限公司生产；汉坦病毒IgG/IgM ELISA检测试剂盒（以下简称进口ELISA试剂盒）由德国IBL公司原装进口；HFRS抗体检测试剂盒（胶体金法）（以下简称胶体金法试剂盒）由厦门市波生生物技术有限公司生产。检测仪器为美国BIO-RADModel550型酶标仪。

1.3 检测方法按照各种检测试剂盒的使用说明书操作。国产和进口ELISA试剂盒的基本操作流程：稀释血清、加样、洗涤、加酶结合物、洗涤、显色、终止后自动酶标仪读值以及判定结果。胶体金法试剂盒基本操作流程：稀释血清、加样以及判定结果。

1.4 统计学处理应用SPSS 16.0软件对实验结果进行统计分析。列四格表，计算相应的指标。组间滴度差异性检验用Wilcoxon秩和检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 国产和进口ELISA试剂盒一致性按照国产和进口ELISA试剂盒对阴性和阳性结果的判定标准，在50份标本中，2种试剂盒检测HFRS IgG抗体结果均为阳性的标本有25份，均为阴性的标本有5份。国产试剂盒相对于进口试剂盒阳性一致率为100%，阴性一致率为20%，相似率为60%（表1）。

表1 国产和进口ELISA试剂盒检测HFRS IgG抗体的一致性(份)Table 1 Consistency between domestic and im ported ELISA kits for the detection of HFRS IgG antibody (sam ples)

2.2 国产和进口ELISA试剂盒灵敏性比较HFRS疫苗接种者HFRS IgG抗体阳性血清倍比稀释后分别用国产和进口ELISA试剂盒进行检测，按照2种试剂盒各自的判断标准，选取最大稀释比例的阳性孔作为其检测灵敏性的数值（表2）。结果表明，国产ELISA试剂盒检测10份HFRS IgG抗体阳性样本的滴度大约高于进口ELISA试剂盒的5倍，说明国产ELISA试剂盒的灵敏性优于进口ELISA试剂盒。

2.3 国产和进口ELISA试剂盒精密度比较分别用国产和进口同一批次ELISA试剂盒检测1份HFRS IgG抗体阳性血清，同时做20孔，计算检测结果的批内变异系数。国产ELISA试剂盒的批内变异系数为3.3%，进口ELISA试剂盒的批内变异系数为2.4%，说明2种ELISA试剂盒精密度均较好。

2.4 国产和进口ELISA试剂盒与胶体金法试剂盒检测结果的一致性

2.4.1 国产ELISA试剂盒与胶体金法试剂盒的一致性按照国产ELISA试剂盒与胶体金法试剂盒对阴性和阳性结果的判定标准，在50份标本中，2种方法检测HFRS IgG抗体结果均为阳性的标本有33份，均为阴性的标本有5份。国产ELISA试剂盒相对于胶体金法试剂盒阳性一致率为100%，阴性一致率为29%，相似率为76%（表3）。

表2 国产和进口ELISA试剂盒检测结果的灵敏性比较（滴度）Table 2 Com parison of the detection sensitivity obtained w ith the domestic and im ported ELISA kits(titer)

表3 国产ELISA试剂盒与胶体金法试剂盒检测HFRS IgG抗体的一致性(份)Table 3 Consistency between the domestic ELISA kits and the colloidal gold method kits for the detection of HFRS IgG antibody(sam ples)

2.4.2 进口ELISA试剂盒与胶体金法试剂盒的一致性按照进口ELISA试剂盒与胶体金法试剂盒对阴性和阳性结果的判定标准，在50份标本中，2种方法检测HFRS IgG抗体结果均为阳性的标本有25份，均为阴性的标本有17份。进口ELISA试剂盒相对于胶体金法试剂盒阳性一致率为76%，阴性一致率为100%，相似率为84%（表4）。

2.5 国产和进口ELISA试剂盒的方法学比较见表5。

3 讨论

当人体感染汉坦病毒或接种HFRS疫苗后不久，在血清中就可检测到HFRS抗体，最早产生的是HFRS IgM抗体，在7～10 d达到高峰，HFRS IgG抗体在发病大约2周时出现，可持续数年。检测HFRS IgM抗体常用于疾病的早期诊断，检测HFRS IgG抗体对于HFRS的诊断、流行病学调查和疫苗接种效果监测具有重要意义[10]。HFRS抗体检测的方法有多种，如间接免疫荧光、ELISA、胶体金法和免疫组化法等。ELISA法因其灵敏、特异、简单、稳定和易于自动化操作等特点，成为实验室检测病毒感染和血清抗体的主要方法之一，也是临床检验科检测HFRS的常用方法。市面销售有多种国产和进口HFRS抗体ELISA检测试剂盒，有必要对其检测性能进行比较研究。本研究比较上海西唐生物科技有限公司和德国IBL公司原装进口的HFRS抗体ELISA检测试剂盒，分别用2种试剂盒检测50份HFRS疫苗接种者血清标本的HFRSIgG抗体，一致性比较结果显示二者的相似率为60%。2种试剂盒阳性检出率有明显差异，国产ELISA试剂盒阳性检出率为90%，进口ELISA试剂盒阳性检出率为50%。将HFRSIgG抗体阳性血清连续进行倍比稀释后进行2种试剂盒的灵敏度检测，结果表明国产HFRS试剂盒的灵敏度约是进口HFRS试剂盒的5倍。2种试剂盒结果判定标准不同，国产HFRS试剂盒以P/N（标本O.D值/阴性对照O.D值）≥2.1为阳性，进口试剂盒以Q（标本O.D值/参照质控O.D值）＞1.5为阳性。这些方法学的差异可能导致了国产ELISA试剂盒与进口ELISA试剂盒的检出率和灵敏度差异较大。

表4 进口ELISA试剂盒和胶体金法试剂盒检测HFRS IgG抗体的一致性(份)Table 4 Consistency between the im ported ELISA kits and the colloidal gold method kits for the detection of HFRS IgG antibody(samples)

表5 国产和进口ELISA试剂盒的方法学比较Table 5 Comparison of themethodology between the domestic and im ported ELISA kits for the detection of HFRS IgG antibody

本实验结果表明国产ELISA试剂盒的阳性检出率高于进口ELISA试剂盒，这可能与国产ELISA试剂盒采用SPA替代抗人IgG抗体有关。既往实验表明，SPA替代抗人IgG抗体有如下特点：SPA制备容易，性质稳定，易于纯化，能应用于人和多种哺乳动物的IgG，不受种属限制，可制成通用试剂，价格较低廉，而抗人IgG抗体的制备须多次免疫动物，在应用上要受同种属的限制[11]；SPA的结合力强，相当于游离抗体与抗原的结合力，结合后对IgG的活性无影响[12]；SPA无论在0、37、44、56℃均能立即与IgG结合而无需长时间孵育，因此可以缩短实验时间[13]，且不易出现抗人IgG抗体长时间孵育过程中出现的抗原抗体解离的问题；但SPA除与IgG结合外，还能与血清中少量的IgM和IgA结合。鉴于此，SPA现已广泛用于ELISA试剂盒的建立，如国内已建立检测狂犬病病毒抗体的SPA ELISA试剂盒[14]、检测冠状病毒抗体的SPA ELISA试剂盒[15]以及用于检测弓形虫抗体的ELISA试剂盒[16]等。

分别用国产和进口同一批次ELISA试剂盒进行精密性实验，计算检测结果的批内变异系数。实验结果表明国产和进口ELISA试剂盒的批内变异系数均小于5%，2种试剂盒的精密度均较好，意味着2种试剂盒检测的重复性好。

胶体金层析技术作为一门成熟的实验诊断技术，近年来已被广泛应用于临床诊断和免疫抗体的监测[17-18]，方法简便、快速、不受条件限制，很适用于基层业务单位使用。据报道用于检测EHF IgG抗体的胶体金法灵敏度和特异度分别为94.9%和100%[19]。国产和进口HFRS抗体ELISA检测试剂盒与胶体金法试剂盒的一致性比较显示：国产ELISA试剂盒与胶体金法试剂盒的相似率为76%；进口ELISA试剂盒与胶体金法试剂盒的相似率为84%。50份血清样本中，胶体金法试剂盒的阳性检出率为66%，介于国产与进口ELISA试剂盒之间。造成阳性检出率差异显著的主要因素是方法的灵敏性、试验结果判定标准等。据检测结果推测国产ELISA试剂盒灵敏度高，进口ELISA试剂盒特异性强。试剂盒的阳性率和一致性的差异提示要根据不同目的合理地选择试剂盒。国产ELISA试剂盒灵敏，价格较便宜，适用于筛选实验；进口ELISA试剂盒特异性强，可用于确证实验；而胶体金法试剂盒操作简单、检测速度快，可用于临床即时检测。

综上所述，国产和进口HFRS抗体ELISA检测试剂盒均使用双抗体夹心ELISA法，操作步骤基本一致，精密度良好，但二者在所用的酶结合物、结果判断方法、灵敏性、特异性、一致性和价格等方面存在较大差异，在实际使用过程中应根据具体实验目的合理地进行选用。

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Com parison of two ELISA kits for the detection of the IgG antibodies against hemorrhagic fever w ith renal syndrome

LIZhuo,ZENG Han-yu,MA Ying,LIU Yuan,ZHANG Rong,LIU Mei-ning,CHEN Li-hua*
Department of Immunology,the Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi710032,China
*Corresponding author,E-mail:chenlh@fmmu.edu.cn

Objective To investigate the performance differences in detecting hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS) IgG Antibodies between domestic and imported ELISA kits.M ethods Domestic and imported ELISA kitswere used to detect HFRS IgG antibodies of the serum samples from 50 HFRS vaccinators,and the consistency,sensitivity,precision and methodology of the two ELISA kitswere analyzed.Results Precision testshowed thatboth the domestic and the imported ELISA kitshad good precision,with the batch coefficientof variation of less than 5%.The positive consistency rate of the two ELISA kitswas 100%,the negative consistency rate was 20%,and the similarity rate was 60%.The sensitivity of the domestic ELISA kitswas 5 times higher than that of the imported ELISA kits,and the differencewas significantbetween the two ELISA kits(P＜0.05).Conclusions The sensitivity of the domestic ELISA kits is higher than that of the imported ELISA kits,the specificity of the imported ELISA kits is higher than that of the domestic ELISA kits,and both the domestic ELISA kits and the imported ELISA kits have good precision for the detection of HFRS IgG antibodies.The selection and application of the domestic or the imported ELISA kits depend on specific requirements.

Hantaan virus;hemorrhagic feverwith renalsyndrome;antibodies;enzyme-linked immunosorbentassay

R373.32；R512.8

A

1007-8134(2015)02-0092-04

国家科技重大专项（2013ZX1004609）；国家自然科学基金青年项目（81401297）

710032西安，第四军医大学免疫学教研室（李卓、曾汉玉、马樱、刘媛、张戎、陈丽华）；710054，西安市卫生学校医学检验教研室（李卓）；712046，咸阳市疾病预防控制中心（刘美宁）

陈丽华，E-mail:chenlh@fmmu.edu.cn