超高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定参松养心胶囊中人参皂苷Rg1和Re含量

陈小娟，李志红，刘 静，刘 贺

(北京以岭药业有限公司，北京 102600)

参松养心胶囊由人参、麦冬、山茱萸、丹参、赤芍、黄连等12味中药组方，具有益气养阴、活血通络、清心安神功效。处方中以人参为君药，其皂苷类成分为主要有效成分[1]。现行质量标准中人参皂苷Rg1和Re的含量测定采用高效液相色谱(HPLC)法[2]，但非常耗时，运行时间一般在90 min以上。本研究中应用超高效液相色谱(UPLC)法技术建立了参松养心胶囊中人参皂苷Rg1和Re的含量测定方法，现报道如下。

1 仪器与试药

Waters Acquity UPLC H－Class system液相色谱仪，包括四元泵处理器、样品处理器、柱温箱及Empower3色谱工作站;ACQUITY ELSD蒸发光检测器。人参皂苷Rg1对照品(批号为110703－201127)，人参皂苷 Re对照品(批号为 110754－201123)，均由中国食品药品检定研究院提供;参松养心胶囊(北京以岭药业有限公司);乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm);流动相:乙腈 －水，梯度洗脱(见表 1);流速:0.45mL/min;柱温:35℃;进样量:2 μL;ACQUITY ELSD检测器条件:漂移管温度为50℃，气体流量为30.0 psi。理论板数按人参皂苷Re峰计算应不低于20 000。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2 溶液制备

取本品30粒的内容物，精密称定，混匀，研细，取约4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率160 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50 mL，蒸干，残渣加水30 mL溶解，用三氯甲烷振摇提取3次(30，20，20 mL)，弃去三氯甲烷液，水溶液用水饱和的正丁醇振摇提取5次(25，25，25，15，15 mL)，合并正丁醇液，用氨试液洗涤 2 次(30，20 mL)，分取正丁醇液，再用正丁醇饱和的水洗涤2次(30，20 mL)，合并氨洗液和水洗液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次(20，20，15 mL)，合并正丁醇提取液，并与上述正丁醇液合并，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取人参皂苷Rg1和人参皂苷Re对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL各含0.2mg的混合溶液，摇匀，作为对照品溶液。按处方工艺比例，自配不含人参的群药，按工艺要求制成不含人参的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

图1 超高效液相色谱图

2.3 方法学考察

空白干扰试验和系统适用性试验:精密吸取2.2项下3种溶液各2 μL，注入液相色谱仪，按拟订色谱条件测定。结果，阴性对照品溶液色谱中，在与人参皂苷Rg1和人参皂苷Re对照品相同保留时间处未见相应色谱峰，故认为阴性无干扰。同时，人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的分离度为2.5，理论板数以人参皂苷Rg1和人参皂苷Re计分别为97 988和100 711，满足系统适用性要求。色谱图见图1。

线性关系考察:取人参皂苷Rg1和人参皂苷Re对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.455 4 mg人参皂苷Rg1和0.415 3 mg人参皂苷Re的对照品贮备液。分别精密吸取对照品贮备液 0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μL，按拟订色谱条件依法进样测定。以色谱峰峰面积对数值(Y)为纵坐标、进样量对数值(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程，人参皂苷Rg1为 Y=0.368 X+3.755 4，r=0.999 1(n=6)，进 样 量 在 0.091 08 ～1.135 8 μg范围内与峰面积线性关系良好;人参皂苷Re为 Y=0.372 X+3.812 1，r=0.999 2(n=6)，进 样 量 在 0.083 06 ～1.038 25 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密吸取对照品溶液(含人参皂苷Rg1 0.227 7 g/L，人参皂苷 Re 0.207 6 g/L)2 μL，连续进样 6 次。结果峰面积的 RSD人参皂苷Rg1为0.91%(n=6)，人参皂苷Re为0.73%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别于 0，1，2，4，8，16，24 h时进样2 μL，计算峰面积的 RSD值。结果的 RSD人参皂苷Rg1为 1.03%(n=7)，人参皂苷 Re 为 0.82%(n=7)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验:取同一批号(批号为1308030)的样品6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果含量的 RSD人参皂苷 Rg1为 1.06%(n=6)，人参皂苷 Re 为 0.88%(n=6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:取已知含量的样品(批号为1308030)6份，每份2 g，精密称定，分别精密加入每1 mL含0.455 4 mg人参皂苷Rg1和0.415 3 mg人参皂苷 Re的对照品贮备液各2mL，按2.2项下供试品溶液制备方法制备溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表2。样测定，按外标两点法对数方程计算供试品中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总量。结果见表3。

3 讨论

2.4 样品含量测定

分别精密称取10批样品，每批2份，按2.2项下方法制备供试品溶液，再分别按拟订色谱条件依照UPLC法和HPLC法[2]进

UPLC法是以1.7 μm的超细色谱柱填料为核心的新兴色谱分离技术[3]，改变的仅是色谱柱的粒径大小，并未改变方法的分离原理[4]。本研究主要通过转换流速、进样量和流动相梯度条件:HPLC上1 mL/min流速转换到UPLC上为0.45 mL/min;HPLC上15 μL的进样量在UPLC上为2 μL;流动相梯度在HPLC[2]基础上进行了调整，使在HPLC上90 min完成的分析在UPLC上用16 min即可完成。

UPLC法分离度、峰容量、分析速度、灵敏度和分辨率均较HPLC法有很大提高，与传统的HPLC法相比，UPLC法的分析速度、灵敏度及分离度分别是HPLC法的9倍、3倍及2倍;在相同色谱条件下，UPLC法能分出更多的色谱峰[5]。HPLC法同时测定人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量一般需1 h以上时间，样品组分才能得到较好地分离。本研究所建立的UPLC法仅需16 min即可完成参松养心胶囊中人参皂苷Rg1和Re的含量测定，分析速度提高了5倍以上，大大减少了溶剂损耗和废液处置费用，减少了环境污染，降低了分析成本。同时，该方法可用于参松养心胶囊人参提取物及中间产品中人参皂苷Rg1和Re含量检测的内控，以缩短检验周期，减少物料库存和中间产品的积压，提高生产效率，起到节能降耗的作用。

表2 加样回收试验结果(n=6)

表3 样品含量测定结果(mg/g)

本研究中还考察了将HPLC用大颗粒色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)直接连接到 UPLC 上，按照 HPLC 法测定条件[2]进行测定。结果表明，HPLC法的测定条件可直接用于UPLC上，测定结果与HPLC法测定结果一致。

[4]，本研究中还曾采用紫外检测器取代蒸发光检测器进行了含量测定摸索试验。检测波长为203 nm，梯度洗脱条件略有改动，其他条件均采用本研究中建立的UPLC－ELSD方法。结果人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的分离度为2.2，理论板数以人参皂苷Rg1和人参皂苷Re计分别为276 215和381 460。可见，UPLC－UV法也可用于参松养心胶囊中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量测定。但由于参松养心胶囊质量标准为《中国药典》[2]法定标准，同时，不同检测器检测信号存在差异，为了尽可能地减少企业内控标准与法定标准的差异，本研究未将参松养心胶囊人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的UPLC－UV含量测定方法纳入企业内控标准，也未进行更深入的方法学研究。

参考文献:

[1]莫炫永.HPLC测定参松养心胶囊中人参皂苷Rb1的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(12):112－114.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版·第二增补本[M].北京:中国医药科技出版社，2013:51－53.

[3]谢耀轩，林亚珠.超高效液相色谱法测定三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[J].广东药学院学报，2011，27(5):489－493.

[4]杨立伟，郑传奇，蒋忠军，等.超高效液相色谱法测定西洋参中人参皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量[J].中药材，2008，31(1):55 － 57.

[5]颜 梅，李诒光，赵 明，等.超高效液相色谱在中药含量测定中的运用[J].亚太传统医药，2011，7(11):176－178.