H3K27me3去甲基化酶Jmjd3调节胎鼠肺上皮细胞增殖和分化

冯 欢，张 超，张哲恺，章 铭，张 丰

（第四军医大学1.学员旅十五连;2.学员旅十三连;3.基础部病理学教研室，陕西西安 710032）

H3K27me3去甲基化酶Jmjd3调节胎鼠肺上皮细胞增殖和分化

冯 欢1，张 超1，张哲恺2，章 铭2，张 丰3*

（第四军医大学1.学员旅十五连;2.学员旅十三连;3.基础部病理学教研室，陕西西安 710032）

目的 分析H3K27me3特异去甲基化酶Jmjd3（KDM6B）在胎鼠肺生长发育过程中的作用。方法 HE染色、PAS染色和免疫组化方法检测E19.5Jmjd3基因敲除胎鼠肺生长发育情况。结果 与野生型（Jmjd3+/+）胚胎比较，杂合型敲除（Jmjd3+/－）胚胎的肺发育稍差，但纯合型敲除（Jmjd3－/－）胚胎肺发育明显不良，支气管的纤毛上皮细胞和Clara细胞以及肺泡的Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞分化不良。Jmjd3－/－胚胎肺上皮细胞增殖指数高于野生型和Jmjd3+/－组，未发现Jmjd3－/－胚胎肺上皮细胞凋亡异常。结论 Jmjd3对胎鼠肺上皮细胞的增殖和分化具有重要调节作用。

Jmjd3;肺上皮细胞;增殖;分化

*通信作者（corresponding author）:zhf1975@fmmu.edu.cn

近年来表观遗传学研究发现核小体组蛋白N-端的氨基酸可发生甲基化和乙酰化等化学修饰，这些修饰组合起来形成“组蛋白密码”，决定基因的转录状态［1］。随着特异产生或降解这些修饰的基因发现，表观遗传分子的功能学研究成为新的研究热点［2-3］。Jmjd3是一个特异降解组蛋白H3第27位氨基酸（赖氨酸）上3甲基（H3K27me3）的组蛋白去甲基化酶［4-8］，Jmjd3敲除基因小鼠实验表明Jmjd3对于巨噬细胞、神经元和软骨细胞发育分化具有重要调节作用［9-11］，由于Jmjd3－/－小鼠出生后 1 ～2 h内死亡，伴全身紫绀，因此Jmjd3－/－小鼠的肺发育可能存在异常［11］，为了检测 Jmjd3是否调节肺发育，本研究从组织学水平探讨Jmjd3在肺上皮细胞的增殖和分化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

Jmjd3+/－小鼠由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所陈德桂研究员惠赠，Jmjd3－/－小鼠由Jmjd3+/－雌雄小鼠交配产生。由于Jmjd3－/－小鼠出生后死亡，因此，本研究以E19.5胎鼠肺组织作为研究对象。抗体如下:兔抗Jmjd3抗体、兔抗AQP5抗体和兔抗 Ki67（abcam公司），兔抗H3K27me3抗体（Millpore公司），兔抗 β-tubulin抗体（GeneTex公司）、兔抗CCSP抗体和兔抗ABCA3抗体（Seven hills bioregents公司）。TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）凋亡检测试剂盒（Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 敲除Jmjd3基因:Jmjd3基因敲除方法见前期研究报道［11］，小鼠遗传背景为 C57/BL6，Jmjd3F/+与EIIa-cre小鼠（Jackson实验室 No.003724）交配产生Jmjd3+/－小鼠。本实验采用5只Jmjd3+/－雄鼠与10只Jmjd3+/－雌鼠交配。每笼放置1只雄鼠和两只雌鼠，24 h后雌雄分开饲养。小鼠在第四军医大学动物实验中心饲养，条件为SPF级别环境，饲养室温度控制在20～23℃，饮用水和饲料经过高温消毒。基因型鉴定所需DNA模板来自胎鼠尾巴，用常规PCR方法鉴定，PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳20 min后，紫外显影仪下拍照分析。基因鉴定引物序列249-F:5'-GAGACCCCTGTTTGGTTACC AG-3';250-F:5'-GCAGTATAAAACCAGAGGAAAC AATG-3';251-R:5'-GAGGCAGAACCTGAGCAAGAC C-3'.以249/251和250/251为引物，PCR产物大小约400 bp。249/251和250/251引物PCR结果双阳性为杂合型敲除，249/251引物PCR结果阳性，而250/251引物PCR结果阴性为野生型，249/251引物PCR结果阴性，而250/251引物PCR结果阳性为纯合型敲除。

1.2.2 组织处理和染色:给E19.5胎鼠编号后，体视镜下剪开每只胎鼠胸腔，取肺组织，4%甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片，厚度为4 μm，切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，对切片进行苏木精和尹红或糖原（PAS）染色，之后无水乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。普通光学显微镜观察小鼠肺组织结构和发育情况。

1.2.3 免疫组织化学染色:石蜡切片脱蜡至水，PBS浸泡5 min。3%H2O2室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗涤5 min×3次（置摇床上）。正常山羊血清封闭，室温孵育30 min，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，4℃过夜。从冰箱取出，室温复温1 h，之后 PBS冲洗，5 min×3次。滴加适量抗兔辣根酶标记二抗（1/500）工作液，室温孵育2 h。PBS冲洗，5 min×3次。DAB显色剂显色1～5 min。蒸馏水冲洗，苏木素衬染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。普通光学显微镜观察小鼠肺发育和分化标记物表达情况。

1.2.4 细胞增殖和凋亡分析:用免疫组织化学染色细胞检测细胞增殖。用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡，方法按照说明书进行。普通光学显微镜观察小鼠肺细胞增殖和凋亡情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Jmjd3基因敲除胎鼠结果

Jmjd3+/－雌雄小鼠交配后19.5 d检测，发现7只小鼠怀孕，处死孕鼠，观察到平均每只孕鼠体内有6～9只胎鼠，共计52只胎鼠。Jmjd3+/+胎鼠有 13 只，Jmjd3+/－胎鼠 27 只，Jmjd3－/－胎鼠12只，一窝代表性胎鼠基因型鉴定结果（图1）。Jmjd3表达强度在Jmjd3+/－胎鼠肺组织略低于Jmjd3+/+的胎鼠肺组织，在Jmjd3－/－胎鼠肺组织检测不到 Jmjd3蛋白信号（图2A～C）。相反，H3K27me3的信号强度在Jmjd3－/－胎鼠肺组织最强（图2D～F）。

图1 小鼠胚胎基因型鉴定Fig 1 Genotype of mouse embryos

2.2 组织形态学分析Jmjd3基因敲除对胎鼠肺发育的影响

每个显微镜低倍视野下Jmjd3+/－胎鼠的肺泡数目略少于Jmjd3+/+胎鼠肺泡的数目，但是Jmjd3+/－胎鼠的肺泡间隔却略宽于Jmjd3+/+胎鼠的肺泡间隔 （图3A:a～f;3B）。另外，Jmjd3+/+胎鼠的大部分支气管上皮细胞顶端已经明显空泡化，而Jmjd3+/－胎鼠的支气管上皮细胞只有少数细胞的顶端出现空泡化 （图3A:c，f;3B）。相对于Jmjd3+/+和Jmjd3+/－胎鼠，Jmjd3－/－胎鼠肺泡数目明显减少，肺泡管腔狭窄或缺如，肺泡间隔明显增厚并且细胞数目增加，而且，Jmjd3－/－胎鼠支气管上皮细胞看不到顶端空泡化细胞 （图3A:a～i;3B）。

2.3 Jmjd3基因敲除对肺上皮细胞分化的影响

相对于Jmjd3+/+和Jmjd3+/－胎鼠，Jmjd3－/－胎鼠细支气管内Tubulin和CCSP阳性细胞明显减少，同时，肺泡内ABCA3和AQP5阳性细胞数目也严重减少（图4）。另外，PAS染色发现Jmjd3－/－胎鼠支气管和肺泡内存在大量含糖类黏液（图5）。

2.4 Jmjd3基因敲除对肺上皮细胞增殖和分化的影响

Ki67在Jmjd3－/－胎鼠肺组织中表达率明显高于Jmjd3+/+和Jmjd3+/－胎鼠组（图 6A:a ～ c，6B）。Jmjd3+/+、Jmjd3+/－和Jmjd3－/－胎鼠肺组织中细胞凋亡没有明显差异（图6A:d～f，6C）。

3 讨论

图2 肺组织的Jmjd3（A～C）和H3K27me3（D～F）的免疫组织化学Fig 2 Immnohistochemistry assays of Jmjd3（A～C）and H3K27me3（D～F）in lung tissues（×200）

图3 组织学方法检测小鼠肺发育情况Fig 3 Developmental status of mice lung were examined by tissue assays

图4 分子标志检测方法分析小鼠肺发育情况Fig 4 Developmental stantus of mice lung by molecalar markers investagations

多种肺疾病的发生与肺早期发育分化不良有关，但是关于肺正常发育的分子机制目前还不完全清楚［12-13］。基因敲除小鼠实验表明转录因子和细胞信号传导分子对肺的正常发育和分化具有重要调节作用，但是有关表观遗传调控分子在肺发育分化过程中的作用还不清楚［12-13］。本研究发现H3K27me3去甲基化酶Jmjd3基因敲除小鼠有明显的肺发育不良，表现为肺泡数目减少、肺泡间隔增宽、处于增殖期的肺泡和支气管上皮细胞数目增加，以及支气管和肺泡内存在大量未吸收黏液。该结果拓展了从表观遗传角度理解肺发育和分化的分子机制，为进一步研究Jmjd3在肺相关疾病中的作用奠定了基础。Jmjd3影响肺上皮细胞分化的实验结果已报道［14］，但是该文献结果没有提及Jmjd3+/－胎鼠的肺发育情况，也没有提及Jmjd3基因敲除对肺上皮细胞增殖和凋亡的影响。本研究用免疫组织细胞化学方法检测到Jmjd3基因敲除后，H3K27me3在肺上皮细胞内整体水平升高，提示Jmjd3促进肺上皮细胞分化与其去甲基化酶的催化活性有关。与该推测一致，Jmjd3直接降解SP-B和AQP5基因启动子上的H3K27me3水平，从而影响肺Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞的分化［14］。结合实验结果，推测Jmjd3蛋白可能直接调节脂滴转运蛋白ABCA3和水通道蛋白AQP5的表达，从而促进肺上皮细胞的分化成熟，Jmjd3基因敲除将导致这些基因无法表达，引起支气管和肺泡内的液体无法被吸收，最终导致Jmjd3－/－胎鼠出生后无法正常呼吸而死亡。

图5 水吸收程度检测小鼠肺发育状态Fig 5 Developmental status of mice lung were exammed by water absorptivity assays

图6 增生和凋亡检测小鼠肺发育情况Fig 6 Developmental status of mice lung were examined by proliferation and apoptisis assays

最近Jmjd3基因敲除小鼠没有明显的肺发育异常［15］，原因是并没有完全敲除Jmjd3，而只是敲除了Jmjd3 的一个剪接体（isoform）［5，14］。由于 Jmjd3 有两个转录起始位点（TSS），其中一个TSS位于第1外显子的上游，另一个TSS位于第1和第2外显子之间［5］。该作者在第1和第2个外显子之间的内含子区域插入1个剪切受体盒子，因此只敲除第1个TSS，结果只敲除了Jmjd3基因的1个剪接体［15］。因此，小鼠表型类似本研究的Jmjd3杂合型基因敲除小鼠，而与本研究的Jmjd3－/－小鼠表型存在明显差异。

综上所述，Jmjd3在支气管和肺泡上皮的发育和分化过程中具有重要作用，其发挥作用的主要机制可能是通过调节 β-Tubulin、CCSP、ABCA3和AQP5等分化基因的表达而促进肺上皮细胞分化，具体的分子机制还需要进一步的工作来验证。

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H3K27me3 demethylase Jmjd3 regulates proliferation and differentiation of embryonal lung epithelia of mice

FENG Huan1，ZHANG Chao1，ZHANG Zhe-kai2，ZHANG Ming2，ZHANG Feng3*

（1.Company 15;2.Company 13，Student Brigade;3.Dept.of Pathology，Basic Medical College，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China）

ObjectiveTo investigate the role of H3K27me3 demethylase Jmjd3（KDM6B）during the development of lung in embryonal mice.MethodsJmjd3knockout embryos of E19.5 mice were examined by HE，PAS and immnohistochemistry assays.ResultsThe developmental defects of the lung of Jmjd3 heterozygous（Jmjd3+/－）embryos were mild is compared toJmjd3+/+embryos.However，Jmjd3－/－mice suffered from the severe hypoplasia of lung tissue.Differentiated defects of ciliated cell，Clara cell，typeⅠ and Ⅱ alveolar epithelial cells were observed inJmjd3－/－embryos.The index of cell proliferation was increased inJmjd3－/－embryos as compared to wildtype andJmjd3+/－embryos.No difference in apoptosis profile was found in these embryos.ConclusionsJmjd3 is essential for proliferation and differentiation of embryonal lung epithelia of mice.

Jmjd3;epithelia of lung;proliferation;differentiation

Q132.7

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.006

1001-6325（2015）09-1176-06

2014-01-19

2015-04-27

国家自然科学基金（31000559）

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