苏云金芽孢杆菌BtZ01对小鼠胚胎和胚后发育的影响

陈波，谷明娟，朱遥，刘勇亮，潘康成

四川农业大学动物医学院 动物微生态研究中心，雅安 625014

苏云金芽孢杆菌BtZ01对小鼠胚胎和胚后发育的影响

陈波，谷明娟，朱遥，刘勇亮，潘康成*

四川农业大学动物医学院 动物微生态研究中心，雅安 625014

为了探讨苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis， Bt) BtZ01对小鼠胚胎发育和胚后生长发育的影响，将48只孕鼠随机分组，试验组饲喂浓度分别为106CFU·mL-1、 108CFU·mL-1、 5×109CFU·mL-1的BtZ01菌液，并设灭菌水为对照组。采用行为致畸学方法检查BtZ01对小鼠胚胎和胚后发育的影响并制作脏器切片，测量脏器指数等指标。结果表明，与对照组相比，各试验组小鼠在胚胎和胚后发育各阶段体重和体长无显著差异(P>0.05)，胚胎畸形发生率无增加，骨骼染色观察发现高剂量组小鼠后囟门显著大于其他3组(P<0.05)。18 d与48 d小鼠部分脏器指数存在显著差异，但病理切片观察发现仅高剂量组肾脏有病变发生。试验结果表明，苏云金芽孢杆菌BtZ01在浓度为108CFU·mL-1及以下时对小鼠胚胎发育及胚后生长发育无不良影响。

苏云金芽孢杆菌；小鼠；行为致畸学；胚胎发育；胚后发育

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)作为一种生物胃毒性杀虫剂，因其对多种害虫具有特异性毒杀作用而倍受人们关注。与化学农药等其他类型的杀虫剂相比，Bt杀虫剂具有杀虫特异性强，对人、畜及非目标昆虫无毒副作用，安全性能好，对环境无污染等特点[1]。但其安全性具有一定的局限性，Bt菌的毒性取决于其血清型或活性成分、浓度等因素，甚至与Bt菌的培养条件也有关系[2]。据报道，部分Bt菌株在108CFU·mL-1浓度下对小鼠鼻腔感染的致死率超过50%，甚至达到100%[3]。而让人们最担心的是许多菌株能够产生肠毒素，从而引发人和动物发病[4-5]。一直以来，人们都在致力于Bt菌的安全性研究，但对于动物直接采食Bt菌制剂后对动物的胚胎及胚后动物的发育、生长是否有影响，至今仍无报道。因此，本试验将不同浓度苏云金杆菌菌液直接给予怀孕小鼠，以观察小鼠胚胎发育及胚后生长发育情况，为苏云金芽孢杆菌的更广泛应用提供理论支持。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 材料

1.1.1 菌株

苏云金芽孢杆菌BtZ01(Bacillus thuringiensis Z01)，由四川农业大学动物医学院发酵工程实验室保存、提供。

1.1.2 试验动物

健康成熟KM小鼠90只，购自四川成都达硕实验动物有限公司。其中雌鼠60只，体重30～35 g，雄鼠30只，体重30～40 g，未交配。

1.1.3 小鼠日粮

试验基础日粮为玉米淀粉-豆粕半纯合日粮，参照小鼠的营养需要，按照动物日粮配方AOAC配制，基础日粮配方及营养水平见表1。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

取苏云金芽孢杆菌BtZ01甘油冷藏菌种，经LB琼脂平板活化后转接到LB肉汤中，37 ℃、160 r·min-1振荡培养36 h。采用稀释平板计数法测定菌液浓度，用灭菌水调整细菌浓度为1×106CFU·mL-1、1×108CFU·mL-1、5×109CFU·mL-1的菌悬液。

表1 小鼠基础日粮配方及营养水平Table 1 Composition and nutrition level of the basal diet of mice

1.2.2 受孕检查及剂量分组

小鼠的饲养与孕鼠的获得参照文献方法[6]。取妊娠0 d的孕鼠48只，随机分成4组，即对照组(1组)、低(2组)、中(3组)和高(4组)剂量组，每组12只。对照组自由饮用无菌水，低、中、高剂量组分别饮用含Bt菌为106CFU·mL-1、108CFU·mL-1、5×109CFU·mL-1浓度的菌悬液。

1.2.3 孕鼠与胚鼠观察

试验采用行为致畸学(常规致畸试验)方法[7]，观察孕鼠活动情况、食物消耗及排便情况，并分别在妊娠的0 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d称量孕鼠体重并记录，以0 d的体重增长率为0.00，计算每3 d的体重增长率。

第n个3d体重增长率=

(1)

孕鼠妊娠18 d称重，每组随机取6只处死，鉴别活胎、死胎、吸收胎等并分离胎盘称重。胎鼠外观畸形检查后用茜素红染色，制成骨标本，测量囟门大小并检测骨骼发育状况[8]。

1.2.4 胚后小鼠的生长发育观察

每组剩余6只孕鼠继续饲喂直至分娩，仔鼠自由饮用与母鼠含相同浓度的Bt菌悬液，分娩后18 d做断奶处理，于48 d试验结束。分别在分娩0 d、18 d和48 d测量小鼠体长并称重。18 d时每组取9只小鼠测量其脏器指数并制作空肠切片，测量肠绒毛高度；48 d时同样方法测量脏器指数，制作脏器切片。肠绒毛高度使用cellSens Standard图像分析软件测量，脏器指数计算公式如下：

(2)

1.2.5 统计分析

使用SPSS 18.0软件对试验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan’s法多重比较差异的显著性，差异显著定义为P<0.05，数据采用“平均数±标准差”表示。

2 结果(Results)

2.1 孕鼠体重增长情况

高剂量组孕鼠在更换饮水2 d内饮水量和摄食量减少明显，之后恢复正常，其他组不明显。称量结果也显示，第1个3 d各组均有小鼠出现体重负增长，这可能是与受孕与饮水更换等应激有关。试验组与对照组之间及试验组各组间孕鼠每3 d的体重增长百分率无显著差异(P>0.05)。

表2 BT菌剂对孕鼠每3天体重增长百分率的影响(%)Table 2 The effect of BT agents on pregnant mice’ weight gain percentage for every 3 days (%)

注：同行间进行多重比较，差异均不显著(P>0.05)。表5同。

Note: Multiple comparisons in the same row, there is no significant difference (P>0.05). The same in table 5.

2.2 胚鼠生长发育情况

孕鼠受精卵发育情况见表3。在孕鼠致畸敏感期给予大剂量的苏云金芽孢杆菌菌剂后，各试验组与对照组在孕卵着床总数、活胎数、死胎和吸收胎率上均无显著差异(P>0.05)。各试验组小鼠胎盘重，胎鼠体重、身长和尾长均与对照组无异(P>0.05)。

表3 BT菌剂对孕鼠生殖能力的影响Table 3 Effect of BT agents on reproductive performance for pregnant mice

注：同列间进行多重比较，肩标中小写字母不同表示差异显著(P<0.05)；字母相同或未标字母者表示差异不显著(P>0.05)。表4、6、7同。

Note: Multiple comparisons in the same column, values with different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05); not marked or marked with the same letter indicated insignificant difference (P>0.05). The same in table 4, 6, 7.

2.3 胎鼠畸形检查

胎鼠外部检查如头颅、面部、脊柱和四肢等发育均正常。骨骼染色检查胸骨、肋骨、脊柱等未发现有骨骼愈合不全、融合、纵裂以及胸骨肋骨缺失等情况。仅高剂量组部分胎鼠胸骨和枕骨着色较浅。囟门测量结果显示高剂量组小鼠后囟门宽度与其他3组差异显著(P<0.05)，各组间前囟门与矢状缝的大小差异不显著(P>0.05)。各组胎鼠囟门发育情况见表4。

2.4 胚后小鼠生长发育情况

母鼠分娩仅有对照组和高剂量组各产下一枚死胎，不具有统计学意义。测量分娩0 d、18 d、48 d的小鼠体重与体长，各组之间并无显著性差异(P>0.05)。小鼠体重与体长见表5。

2.5 胚后小鼠脏器指数变化

18日龄和48日龄小鼠脏器指数见表6。18 d时，高剂量组小鼠心脏指数明显高于对照组(P<0.05)；中、高剂量组小鼠肾脏指数显著高于对照组(P<0.05)；试验组小鼠胸腺指数均高于对照组(P<0.05)；各组小鼠的肝脏指数和脾脏指数差异均不显著(P>0.05)。48 d时，中、高剂量组小鼠的肾脏指数显著高于对照组(P>0.05)；高剂量组小鼠的肝脏指数显著高于对照组(P<0.05)；其他脏器指数在4组之间无差异(P>0.05)。

2.6 胚后小鼠肠道形态观察

由表7可知，18 d时，各试验组与对照组小鼠的空肠绒毛高度、腺窝深度以及绒毛高度/腺窝深度比值并不存在差异(P>0.05)。48 d中、高剂量组小鼠肠绒毛和肠绒毛高度/腺窝深度比值均显著高于对照组(P<0.05)，各组间腺窝深度无差异(P>0.05)。

2.7 病理变化观察

显微镜下可见各组小鼠肝脏和脾脏均未出现病理变化。肝脏组织结构清晰，肝索排列整齐，肝小叶无肿胀和坏死，无炎性细胞浸润和纤维结缔组织增生(图1)。脾脏组织细胞结构正常，生发中心明显，红白髓界限清晰(图2)。仅高剂量组小鼠肾脏有病变发生，主要表现为细胞肿胀，细胞间隙模糊，肾小囊腔变窄，其他3组无病变(图3)。

表4 BT菌剂对胎鼠囟门发育的影响Table 4 Effect of BT agents on fontanels’ development of fetal mice

表5 胚后小鼠体重与体长Table 5 Weight and length of post-embryonic mice

表6 小鼠器官指数(%)Table 6 The organ indexes of instar mice (%)

表7 BT菌剂对小鼠小肠形态的影响Table 7 The effect of BT agent on intestinal morphology of mice

图1 48日龄小鼠肝脏组织切片(H.E. 200×)Fig. 1 Liver tissue of 48- days mice (H.E. 200×)

3 讨论(Discussion)

苏云金杆菌含有多种毒素成分，但其杀虫活性主要取决于产品中芽孢数量和伴孢晶体蛋白(ICPs)的表达量[9]，即产品的毒效与发酵液中芽孢含量存在一定的相关性。本试验使用36 h的Bt培养物制备菌悬液，不仅含有丰富的芽孢与伴孢晶体蛋白，同时还包含有营养期杀虫蛋白在内的其他活性产物，能够很好的模拟实际产品情况。

试验使用Bt培养物直接饲喂孕鼠，首先探究了其在生殖发育敏感时期对胚胎的影响。当一些高脂溶性药物和小分子物质通过胎盘直接作用于胚胎时，便会发生胚胎毒性，表现为胚胎体重下降、发育迟缓和胚胎吸收等现象[10]。试验中，各组胎盘、体重、体长无差异，吸收、死胎率无上升趋势，这些数据显示胎儿未出现胚胎毒性。骨骼检查虽未有明显的畸形发生，但高剂量组有骨骼着色较浅，可能是骨化不全或者是发育缓慢。囟门大小测量显示高剂量组小鼠与其他组存在差异。由于囟门的大小可作为颅骨骨化和发育速度的标志[11]，因此可认为高剂量的Bt可能对胎鼠的发育有延迟作用。

小鼠胚后发育的影响主要以脏器指数、空肠绒毛发育情况和病理切片为依据。试验结果显示，胚后小鼠的体重，各剂量组虽与对照组没有显著差异，但各剂量组均比对照组高，表明Bt菌对胚后小鼠具有一定的促进生长作用。Bt中含有的部分非杀虫活性成分，如：苏云金素(Thuringiensin)、溶血素(Hemolysin)、肠毒素(Enterotoxin)和免疫抑制因子A(InA)等，虽表达分泌较少，但其本身对人和哺乳动物存在潜在的毒性作用[12]。高剂量小鼠出现了肾脏毒性，可能是因为BtZ01能够分泌产生上述一种或多种活性物质，长期大剂量的摄入导致毒性作用的积累。脏器指数被认为是反映毒性成分对脏器影响的重要指标[13]，但试验结果显示，脏器指数有显著差异的，切片观察不一定有病变。对两者结合可见，仅高剂量组小鼠肾脏有病变发生。其他无病变但脏器指数增加的器官，可能是充分行使其功能所致。另外，单纯使用脏器指数来评判病变情况并不准确，实践中必须结合多种方法进行综合评判方可定论。小肠绒毛的发育情况及肠道内环境不仅决定着机体消化吸收能力的强弱，更反映出机体的健康状况。中、高剂量组小鼠的肠绒毛高度明显高于对照组，还有可能与绒毛另一个重要功能有关：通过其强有力、有规律摆动来排斥有害菌群的定植[14]。

大量的研究表明，Bt对小鼠产生毒性的最低剂量为108CFU·mL-1，对人类产生毒性的最低剂量应按照体重比进行转换，为小鼠的1 000倍。而调查研究表明，即使是从事生物农药喷雾的工人，整个喷雾季节的累计Bt接触量还不到109CFU(小鼠转换剂量为106CFU)[2]。试验中，中、低剂量组小鼠未有任何毒性作用体现，相反在部分脏器和肠道发育上还表现出Bt对其具有一定促进作用；高剂量组小鼠一方面也存在着部分脏器功能更加完善的现象，另一方面却表现出一定程度的毒性作用。以上试验结果表明BtZ01作为生物杀虫剂使用时对人与大型哺乳动物具有较高的安全性；但生产实践时也应同时根据小型哺乳动物与产品的接触系数以及出现毒性的最低剂量，控制产品的最高浓度并制定科学、合理的用药方案(用药途径、用药时机以及用药间隔期等)，确保其对小型哺乳动物的安全性。

综上可知，给予怀孕母鼠和胚后小鼠自由饮用含有108CFU·mL-1及以下浓度的苏云金芽孢杆菌菌悬液，对小鼠胚胎及胚后小鼠生长发育未产生不良影响；浓度提高为5×109CFU·mL-1时，则可导致小鼠出现肾脏毒性并出现发育迟缓的现象。

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◆

Impact ofBacillusthuringiensisBtZ01 on Growth and Development in Embryonic and Post-embryonic Periods of Mice

Chen Bo, Gu Mingjuan, Zhu Yao, Liu Yongliang, Pan Kangcheng*

Research Center of Animal Microecology, College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China

19 September 2014 accepted 27 October 2014

This study was to investigate the impact of Bacillus thuringiensis BtZ01 on growth and development in embryonic and post-embryonic periods of mice. Forty eight pregnant Kunming mice were randomly assigned into four groups. The control group was fed with sterilized water and the treated groups were fed with sterile saline containing 106CFU·mL-1, 108CFU·mL-1, 5×109CFU·mL-1BtZ01, respectively. In the present study, the body weight and organ weight ratios were measured, and as well as bone malformations and microscopic pathology were examined. Results indicated that there were no significantly differences between the control and the treated groups for mice’s length and weight gain (P>0.05). The malformations ratios of the control and the treated groups were not different (P>0.05). However, the fontanels of high-dose group (5×109CFU·mL-1BtZ01) were wider and their kidneys were changed, compared with the control groups. Generally, our results showed that the Bacillus thuringiensis BtZ01 has no adverse or toxic effects on embryonic and post-embryonic mice in a dose of 108CFU·mL-1.

Bacillus thuringiensis; mice; behavioral teratogenicity; embryogenesis; post-embryonic development

“教育部长江学者和创新团队发展计划”创新团队资助项目(IRT0848)；四川农业大学创新性实验计划和科研兴趣培养计划(1310626013)

陈波(1991-)，男，硕士，研究方向为动物微生态学，E-mail: chenbob2009@hotmail.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: pankangcheng71@126.com

10.7524/AJE.1673-5897.20140919003

2014-09-19 录用日期：2014-10-27

1673-5897(2015)2-325-07

X171.5

A

潘康成(1971—)，男，博士，教授，主要从事动物微生态学研究。

陈波, 谷明娟, 朱遥, 等. 苏云金芽孢杆菌BtZ01对小鼠胚胎和胚后发育的影响[J]. 生态毒理学报, 2015, 10(2): 325-331

Chen B, Gu M J, Zhu Y, et al. Impact of Bacillus thuringiensis BtZ01 on growth and development in embryonic and post-embryonic periods of mice [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 325-331 (in Chinese)