金黄色葡萄球菌五种肠毒素基因PCRDHPLC检测方法的建立

陈 彬,王 颖,郑 晶,黄晓蓉,林 杰,彭华毅,邵碧英,*

(1.福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心,福建福州 350001；2.福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州 350001；3.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002)

陈 彬1,2,王 颖1,3,郑 晶1,2,黄晓蓉1,2,林 杰1,2,彭华毅1,2,邵碧英1,2,*

(1.福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心,福建福州 350001；2.福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州 350001；3.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002)

本文设计合成了5种肠毒素基因的特异性引物,对PCR的退火温度、DNA模板量进行优化,建立了5种肠毒素基因(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)的聚合酶链式反应-变性高效液相色谱(PCR-DHPLC)检测方法,并测定方法的灵敏度和特异性。结果表明建立的PCR-DHPLC检测方法的特异性很好,灵敏度可达到100cfu/mL。PCR-DHPLC方法具有快速、准确、高通量等优点,在进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测上有很好的应用价值。

金黄色葡萄球菌,肠毒素,聚合酶链式反应(PCR),变性高效液相色谱(DHPLC)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是葡萄球菌属的一种,在自然界中广泛存在,主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉及头发,有30%～80%的人群携带该病原菌[1-3],由其产生的肠毒素可通过污染食品而导致食物中毒。因此,该菌也是进出口食品中要求检测的常见的微生物项目。传统的金黄色葡萄球菌肠毒素基因型有5种,分别是SEA、SEB、SEC、SED和SEE[4]。人在进食携带该肠毒素污染的食物1～5h,会出现急性肠胃炎的症状,表现为恶心、呕吐和腹泻等。近年来,在中国发生的细菌性食物中毒病例中,由金黄色葡萄球菌引起的中毒事件占20%～25%,名列第四位[5-6],国际上已将葡萄球菌肠毒素的检测列入食品检验法规。聚合酶链反应(PCR)技术具有快速、灵敏等特点,在葡萄球菌肠毒素基因的检测上已有报道,但多采用凝胶电泳法检测PCR产物,步骤繁琐,易造成污染。变性高效液相色谱(DHPLC)是一种新型高通量筛选DNA序列的新技术,可用于PCR产物的快速分析。DHPLC具有全自动、高通量的特点,一次可同时分析数百个样本。Franciosa等[7]、Hurtle等[8]与曹际娟等[9]均报道了利用DHPLC技术对细菌进行检测的研究,

但尚未见将DHPLC技术应用于葡萄球菌肠毒素检测的报道。本文选取金黄色葡萄球菌5种肠毒素基因,拟建立5种肠毒素基因的PCR-DHPLC检测方法,为进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的快速、高通量检测提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

金黄色葡萄球菌标准菌株共5株,分别是金黄色葡萄球菌产SEA菌(ICQQ22024)、金黄色葡萄球菌产SEC菌(ICQQ22028)、金黄色葡萄球菌产SED菌(ICQQ22003),中国检验检疫科学研究院；金黄色葡萄球菌产SEB菌(F0137)和金黄色葡萄球菌产SEE菌(T43),本实验室保存。

1.2 主要试剂与设备

dNTP、2×Taq PCR Master Mix、DNA marker Ⅰ、细菌基因组DNA提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司；TEAA、DNA标样 北京市表观生物技术有限公司；变性高效液相色谱仪 美国Transgenomic公司。

1.3 引物

根据基因序列数据库(GenBank)中收录的5种葡萄球菌肠毒素(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)基因和特异基因femA的序列,并在美国生物技术信息中心(NCBI)上进行序列比对后筛选各自的特异性扩增片段,利用Primer5.0软件设计引物,委托上海生工公司合成以下引物(表1)。引物用TE溶液(pH8.0)稀释至浓度为10μmol/L,-20℃保存备用。

1.4 细菌DNA的提取

各取5株金黄色葡萄球菌标准菌株冻干粉,分别溶解于7.5% 氯化钠肉汤中,于(36±1)℃培养18～24h,将培养物划线接种到Baird-Parker平板,(36±1)℃培养18～24h。挑取平板上典型单菌落接种到5mL BHI培养液中,在台式恒温振荡器(36±1)℃振荡培养12h。取50株非金黄色葡萄球菌的甘油保存液100μL,接种于4mL营养肉汤,(36±1)℃培养18～24h。各取1mL菌悬液,按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取DNA,经10倍稀释后,于核酸蛋白仪上测定浓度和纯度,并用TE溶液(pH8.0)稀释至50ng/μL,-20℃保存备用。

1.5 PCR反应条件中退火温度的优化

通常情况下,退火温度为引物Tm值减5℃,也即55℃,表1所列的六对引物的Tm值平均在60℃,而且Taq DNA 聚合酶在50℃时效率最高,因此,选择在55℃上下范围内,进行退火温度的优化。以常用的反应体系为基础,使用梯度PCR仪对退火温度进行优化。PCR反应体系:2×Taq PCR MasterMix 10μL,引物各0.5μL,DNA模板50ng,ddH2O 补至20μL。PCR扩增程序:94℃预变性5min；94℃变性40s,51～58℃退火40s,72℃延伸1min,35个循环；72℃延伸7min。PCR扩增结束后,取10μL PCR产物,经20mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测,选出最佳退火温度。

1.6 PCR反应体系中DNA模板量的优化

以常用的反应体系为基础,将模板DNA量分别设置为0、10、20、30、40、50、60、70ng共8个浓度梯度,用1.5中优化好的退火温度进行PCR扩增。PCR扩增结束后,取10μL PCR产物电泳、成像拍照,筛选出最合适的模板DNA用量。

1.7 PCR-DHPLC检测方法的建立

PCR反应体系、反应条件同1.5,取优化后的退火温度与DNA模板量,参照1.5中的反应体系与反应条件进行PCR扩增。反应结束后,取5μL PCR产物进行DHPLC检测。洗脱液由缓冲液A(0.1mol/L的TEAA,加250μL乙腈)及缓冲液B(0.1mol/L的TEAA,含25%的乙腈)组成,以0.9mL/min的流速在50℃柱温下自动洗脱DNA分子,跑样时间是20min,以标准分子量为参照,根据峰对应的碱基对大小判断PCR产物是否正确。

1.8 PCR-DHPLC检测方法的特异性测定

取50株非金黄色葡萄球菌的甘油保存液100μL,接种于4mL营养肉汤,36±1℃培养18～24h。各取1mL菌悬液,按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取DNA。以金黄色葡萄球菌标准菌株的DNA作为阳性对照,以ddH2O作为空白对照,用建立的PCR-DHPLC方法检测50株非金黄色葡萄球菌的肠毒素基因,以验证该方法的特异性。

1.9 PCR-DHPLC检测方法的灵敏度测定

接种金黄色葡萄球菌标准菌株于BHI培养液中,(36±1)℃摇床培养12h,将培养后菌悬液分别进行10倍系列稀释,选择合适的稀释度,各吸取1mL稀释液于菌落计数片中经培养后进行菌落计数。同时,各取1mL稀释液,用试剂盒法提取DNA。DNA提取完毕,分别取2μL DNA模板按照上述确定的反应条件进行PCR扩增。反应结束后,取5μL PCR产物进行DHPLC检测。

1.10 PCR-DHPLC检测方法的实际应用

将建立的PCR-DHPLC检测方法用于本实验室近年来从食品样品中分离到的金黄色葡萄球菌的检测。吸取甘油保存的菌液50μL于BHI培养液,36±1℃摇床培养12h。吸取1mL菌悬液,12000r/min离心2min,弃上清。若沉淀太少,再取1mL菌悬液进行离心操作。用试剂盒法提取DNA,进行PCR-DHPLC检测。

2 结果与分析

2.1 5对引物PCR退火温度的优化结果

图1 5对引物PCR扩增退火温度的优化结果Fig.1 The optimization results of annealing temperature of five primers in PCR procedure注：M.DNA Marker I；A. SEA基因；B. SEB基因； C. SEC基因；D. SED基因；E. SEE基因； 1～8. 退火温度分别为51、52、53、54、55、56、57、58℃。

分别对合成扩增5种肠毒素基因的5对引物的退火温度进行优化,共选取了8个温度,结果如图1所示。随着退火温度的逐步升高,不同的引物目的条带的亮度变化不同。对于SEA基因,随着温度的升高,目的条带亮度稍有增强；对于SEB基因,随着温度的升高,目的条带亮度稍有减弱；对于SEC基因,随着温度的升高,目的条带亮度稍有增强,但在51～54℃时,有杂带的出现,而从55℃开始不再有杂带；对于SED基因,随着温度的升高,目的条带亮度差异不明显；对于SEE基因,随着温度的升高,目的条带的亮度稍有减弱趋势。综合考虑到既能保证各对引物都得到较好的扩增,又减少非特异条带的产生,选取55℃为适宜的退火温度。

2.2 DNA模板用量的优化结果

对DNA模板用量进行优化,电泳结果如图2所示。随着DNA模板用量的逐渐增加,5对引物的目的条带的亮度变化程度相差不大。当DNA模板量为0时,没有出现任何条带,与预期结果相符；当DNA模板量从10ng到70ng逐渐增加时,预期目条带的亮度逐渐变亮,但整体上条带变亮的趋势并不明显。因此,从10ng到70ng均可作为合适的DNA模板用量。既能保证PCR有效扩增,又能节约DNA模板,因此选取居中的50ng为适宜的DNA模板用量。

图2 DNA模板用量的优化结果Fig.2 The optimization results of DNA amount注：M.DNA Marker I；A.SEA基因；B.SEB基因； C.SEC基因；D.SED基因；E.SEE基因； 1～8.DNA模板的量分别为0、10、20、30、40、50、60、70ng。

表2 PCR-DHPLC检测法特异性测定结果Table 2 The specific detection results of PCR-DHPLC method

注:“-”-无吸收峰出现。2.3 5种肠毒素基因的PCR-DHPLC检测结果

本文除了5型肠毒素基因外,还增加了金黄色葡萄球菌特有的femA基因,以检验金黄色葡萄球菌DNA的提取效果、并避免出现假阴性结果。将femA基因和5种肠毒素基因分别进行PCR-DHPLC法检测,图谱的横坐标表示出峰时间(min),各PCR产物均为单一峰,且碱基数多的出峰时间长,出峰位置与预期的吻合(图3)。金黄色葡萄球菌特异基因femA基因峰(132bp)位于102bp峰和174bp峰之间,靠近102bp峰；产SEA标准菌株阳性峰(218bp)基本位于174bp峰和257bp峰的中间；产SEB标准菌株阳性峰(477bp)位于458bp峰和582bp峰之间,靠近458bp峰；产SEC标准菌株阳性峰(282bp)基本位于267bp峰和298bp峰之间；产SED标准菌株阳性峰(330bp)基本位于298bp峰和434bp峰之间,靠近298bp峰；产SEE标准菌株阳性峰(400bp)基本位于298bp峰和434bp峰之间,靠近434bp峰(图8)。检测结果表明经优化后建立的PCR-DHPLC检测方法不仅适用于5种肠毒素基因,也适用于金黄色葡萄球菌特有的femA基因。

图3 5种葡萄球菌肠毒素基因 及femA基因PCR-DHPLC检测结果Fig.3 The PCR-DHPLC results of five enterotoxins genes and femA gene注1.Wave DNA sizing control(80、102、 174、257、267、298、434、458和587bp)； 2. SEA；3. SEB；4. SEC；5. SED；6. SEE；7.femA基因。

2.4 PCR-DHPLC法的特异性测定结果

用建立的PCR-DHPLC法检测本实验室保存的50株非金黄色葡萄球菌的标准株和分离株的特异性检测结果见表2,测定的结果只有金黄色葡萄球菌标准菌株出现预期峰,而非目标菌株均未出现任何峰。以大肠埃希氏菌、沙门氏菌测定结果为例如图4,只有金黄色葡萄球菌标准菌株扩增出了相应的目的条带,而大肠埃希氏菌、沙门氏菌菌株以及ddH2O均没有出现任何条带。测定结果表明建立的PCR-DHPLC方法的特异性很好。

图4 特异性实验DHPLC观察结果Fig.4 The specific experimental DHPLC results注:1.Wave DNA sizing control(80、102、174、 257、267、298、434、458、587bp)； 2.金黄色葡萄球菌标准菌株；3.ddH2O； 4.大肠埃希氏菌(ATCC 25922)；5.沙门氏菌(ATCC 13076)。

2.5 PCR-DHPLC法的灵敏度测定结果

5种葡萄球菌肠毒素PCR-DHPLC检测灵敏度的测定结果如图4所示。随着菌含量的逐渐减少,DHPLC检测结果显示的特异峰面积越来越小。SEA最低能检测到53cfu/mL,SEB能检测到36cfu/mL,SEC能检测到45cfu/mL,SED能检测到32cfu/mL,SEE能检测到41cfu/mL。即对于5种肠毒素基因,PCR-DHPLC的灵敏度均可达到100cfu/mL。

图5 5种肠毒素基因PCR-DHPLC 检测方法的灵敏度测定结果Fig.5 The sensitivity detection results of PCR-DHPLC method of five enterotoxins genes注：A. SEA；B. SEB；C. SEC；D. SED；E. SEE； 1. Wave DNA sizing control；A2～5分别为: 103、102、53、5cfu/mL；B2～5分别为: 103、102、36、3cfu/mL；C2～5分别为: 103、102、45、4cfu/mL；D2～5分别为: 103、102、32、3cfu/mL；E2～5分别为: 103、102、41、4cfu/mL。

2.6 PCR-DHPLC检测方法的实际应用结果

将建立的PCR-DHPLC方法用于本实验室近几年从食品样品中分离的金黄色葡萄球菌的检测,共检测了80株金黄色葡萄球菌,样品菌株来源于多种食品样品,主要有水产品:虾、蟹、蚬子、干贝及各种鱼类；肉及肉制品:牛肉和鸡肉制品；果蔬类:冷冻菜、毛豆和食用菌；粮食及其制品等。检测结果显示,80株金黄色葡萄球菌中有47株含有肠毒素基因,阳性率为58.75%,肠毒素基因型分布情况见表3。只含1种肠毒素基因的有33株,其中只含SEA基因的有20株,只含SEB基因的有3株,只含SEC基因的有9株,只含SEE基因的有1株。同时含有2种肠毒素基因的有13株,其中含SEA、SEC基因的有4株,含SEA、SEE基因的有1株,含SEB、SEC基因的有7株,含SEC、SED基因的有1株。同时含有3种肠毒素基因(SEA、SEB和SEC)的菌株仅有1株。3 结论与讨论

表3 80株金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布情况Table 3 The enterotoxin gene distribution of eighty strains Staphylococcus aureus

应用本文建立的PCR-DHPLC方法检测金黄色葡萄球菌肠毒素,从对样品进行增菌,取增菌液提取DNA,到采用PCR-DHPLC方法检测,只需2d时间就可出结果。而传统的检测方法采用细菌分离培养方法,对金黄色葡萄球菌的检测就需3～6d,而且检测灵敏度不高,易导致漏检,如果对检出的金黄色葡萄球菌是否产肠毒素还要花费数天以上时间,耗时更长。另外,本实验应用DHPLC方法代替琼脂糖凝胶电泳,不仅可以省掉点样、电泳、染色和观察等较为繁琐的步骤,还可以避免接触凝胶电泳中潜在的致癌物质-溴化乙锭,只需将PCR反应管放入自动进样器,设定好程序,便能自动完成数百个样品的检测,在业务量大的情况下,该方法的应用,可达到高通量检测的目的,而且大大缩短检测周期。

本文以SEA～SEE为研究对象,建立的金黄色葡萄球菌肠毒素的PCR-DHPLC检测方法,灵敏度高、特异性强,克服其它方法的局限性,达到快速、简便、准确、高通量的目的。能够应用于金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测及分型,对预防和诊断由肠毒素引起的食物中毒,保障食品卫生安全具有十分重要的意义。

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Development of PCR-DHPLC detection method forfive types of Staphylococcal enterotoxin genes

CHEN Bin1,2,WANG Ying1,3,ZHENG Jing1,2,HUANG Xiao-rong1,2,LIN Jie1,2,PENG Hua-yi1,2,SHAO Bi-ying1,2,*

(1.Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Fuzhou 350001,China；2.Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research,Fuzhou 350001,China；3.College of Food Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Five pairs of primers were designed and synthesized for five Staphylococcal enterotoxins genes(SEA,SEB,SEC,SED,SEE). The PCR-DHPLC detection methods for five Staphylococcal enterotoxins genes were established after optimizing of the annealing temperature and DNA template amount. The sensitivity and specificity of the detection method were then determined. The results showed that the PCR-DHPLC method could detect specifically of Staphylococcal enterotoxins genes with detection limit of 100cfu/mL. The PCR-DHPLC detection method had some advantages,such as rapid,accuracy and high throughput. The PCR-DHPLC method had fine application value to detecting Staphylococcal enterotoxins in import and export foods.

Staphylococcusaureus；enterotoxin；PCR；DHPLC

2014-04-29

陈彬(1969-)，女，学士，高级工程师，研究方向：食品微生物检测。

*通讯作者:邵碧英(1973-)，女，博士，研究员，研究方向：食品微生物检测。

福建省科技厅自然科学基金项目(2012J01062) ；福建局科技项目(FK2012-25)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)03-0172-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.027