高脂致非酒精性脂肪肝动物模型肝脏形态学动态研究

谭丽萍石安华马 洁姚 政殷 华陈文慧*

1.云南中医学院实验中心，云南 昆明 650500；2.云南中医学院基础医学院，云南 昆明 650500

高脂致非酒精性脂肪肝动物模型肝脏形态学动态研究

谭丽萍1石安华2马 洁2姚 政2殷 华2陈文慧2*

1.云南中医学院实验中心，云南 昆明 650500；2.云南中医学院基础医学院，云南 昆明 650500

目的：利用高脂饲料建立非酒精性脂肪肝动物模型，为非酒精性脂肪肝的中药治疗效果提供基础。方法：将70只清洁级SD大鼠随机分为2组，即正常组20只、模型组50只，正常组随机分为5组，每组4只；模型组随机分为5组，每组10只。正常组给予普通饲料喂养，模型组给予高脂饲料喂养。于第四周、第六周、第八周、第十周、第十二周分别处死1组正常组和1组模型组。观察大鼠肝脏大体观，称量肝脏湿重，计算大鼠肝体比，并将肝脏进行石蜡切片HE染色和冰冻切片苏丹三染色。结果：从第四周末开始，模型组大鼠肝湿重增高，与正常组大鼠肝湿重比较差异具有统计学意义，并在第六周末、第十周末、第十二周末出现显著差异。从第六周末开始模型组肝指数增高与正常组肝指数比较差异具有统计学意义。肝脏镜下观从第四周开始出现轻度脂肪肝，并随着造模时间的延长，不断加重。结论：利用常规高脂饲料 （88%普通饲料中加入10%猪油和2%胆固醇）造非酒精性脂肪肝动物模型，于造模后第四周即出现非酒精性脂肪肝，并随着时间延长不断加重。

高脂；非酒精性脂肪肝；模型

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）俗称脂肪肝，是指以肝实质细胞脂肪变性为病理特征而无过量饮酒史及其他肝病的临床综合征，其病理类型包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH）及NASH相关肝硬化，后者可发展为肝癌［1－2］。随着生活水平的不断提高，人们从饮食中摄取的高脂物质越来越多，出行交通便利，工作压力大，运动量减少，导致其发病率逐年上升。课题组致力研究活血化瘀方对非酒精性肝病的治疗效果，成功建立了NAFLD的模型，为今后的治疗研究提供了良好地基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠，清洁级，体重（100± 10）g，70只。购自四川省成都达硕生物有限公司，许可证号：SCXK（川）2014－23。

1.2 实验仪器以及试剂 猪油自制；胆固醇 （批号：20130201，安徽天启化工科技有限公司）；YP10002电子天平（上海光正医疗仪器有限公司）；YD1508B轮式切片机（浙江金华益迪医疗设备厂）；HI1220烘片机（德国LEICA公司）；HI1210摊片机（德国LEICA公司）；CM1860UV冷冻切片机（德国LEICA公司）

1.3 高脂饲料的配制［3］88%普通饲料中加入10%猪油和2%胆固醇。

1.4 实验方法 将70只清洁级雄性SD大鼠随机分为2组，即正常组20只、模型组50只，正常组随机分为5组，每组4只；模型组随机分为5组，每组10只。正常组给予普通饲料喂养，模型组给予高脂饲料喂养。各组自由饮水。1.5 处理方法 大鼠实验前禁食不禁水12h，次日以10%水合氯醛溶液0.25ml／100g进行腹腔注射麻醉。取血后，处死大鼠，迅速取肝组织称重。后将肝脏浸泡于10%中性福尔马林内固定，进行石蜡切片和冰冻切片。

1.6 诊断标准

1.6.1 脂肪肝病理诊断标准［4］低倍镜下，肝细胞脂肪变性占肝小叶1／3～1／2者为轻度脂肪肝；占肝小叶1／2～3／4者为中度脂肪肝；占肝小叶3／4以上或者肝细胞弥漫脂肪性变性呈渔网状者为重度脂肪肝。

1.6.2 肝指数的测定［4］动物处死后，立即取肝脏，滤纸吸干表面水分后称其湿重，计算肝指数：肝指数＝肝脏重量（g）／体重（g）×100%。

1.7 统计方法 数据采用SPSS 18.0软件进行统计处理，计量资料用均数±标准差 （±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体重、肝湿重以及肝指数变化情况 由表1可知，随着时间的延长，大鼠体重在不断增加，但各时间段正常组和模型组之间没有统计学差异。从第四周末开始，模型组大鼠肝湿重增高，与正常组大鼠肝湿重比较差异具有统计学意义（P＜0.05），并在第六周末、第十周末、第十二周末出现显著统计学差异（P＜0.01）；从第六周末开始模型组肝指数增高与正常组肝指数对比差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 正常组和模型组大鼠体重、肝湿重、肝指数比较 （±s）

表1 正常组和模型组大鼠体重、肝湿重、肝指数比较 （±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 体重／g 肝湿重／g 肝指数／% 4周正常组（n＝4） 270.55±19.95 8.70±0.72 3.22±0.26 4周模型组（n＝10） 279.65±24.64 10.01±1.63* 3.59±0.57 6周正常组（n＝4） 330.30±31.21 8.98±0.98 2.76±0.16 6周模型组（n＝10） 358.50±30.21 11.20±1.03** 3.07±0.13**8周正常组（n＝4） 364.21±42.85 9.44±1.86 2.58±0.29 8周模型组（n＝10） 367.22±47.01 11.79±1.93* 3.22±0.26**10周正常组（n＝4） 410.18±25.55 8.88±0.47 2.20±0.16 10周模型组（n＝10） 431.48±64.67 12.67±3.27** 2.90±0.37**12周正常组（n＝4） 410.33±34.93 9.66±0.97 2.36±0.21 12周模型组（n＝10） 437.00±32.24 13.89±1.84** 3.18±0.32**

2.2 肝脏病理学变化

2.2.1 肝脏肉眼观察结果 正常组大鼠肝脏颜色为均匀的暗红色，边缘锐利，质韧。模型组肝脏体积明显增大，颜色呈现红黄相间，并随着时间的延长肝脏颜色越来越白，边缘变圆钝，包膜紧张，质地变脆。见图1。

2.2.2 肝脏镜下观察

2.2.2.1 不同造模时间各个实验组动物肝脏脂肪变性情况正常组大鼠肝脏全部正常，没有发生脂肪变性，第四周模型组大鼠肝脏轻度脂肪肝占100%；第六周模型组轻度脂肪肝占10%，中度脂肪肝占80%，重度脂肪肝占10%；第八周模型组轻度脂肪肝占10%，中度脂肪肝占20%，重度脂肪肝占70%；第十周模型组中度脂肪肝占10%，重度度脂肪肝占90%；第十二周模型组重度脂肪肝占100%。具体见表2。

2.2.2.2 肝脏病理组织学描述 各周次正常肝组织石蜡切片HE染色、冰冻切片苏丹三染色镜下结构均正常，肝血窦清晰，肝索以中央静脉为中心呈现放射状，肝细胞结构清晰，细胞质丰富，细胞核位于细胞中央。见图2

表2 正常组和模型组大鼠肝脏脂肪变性程度的统计

石蜡切片HE染色，第四周模型组肝组织、肝细胞出现轻度脂肪变性，肝细胞内出现少量的微小的脂肪空泡，肝索、肝血窦较清晰；第六周模型组肝组织、肝细胞出现中度脂肪变性，肝细胞内出现中等量大小不等的空泡，肝细胞体积增大，肝索排列紊乱，肝血窦狭窄甚至消失；第八周模型组肝组织、肝细胞出现重度脂肪变性，肝细胞内有大量大小不等的脂滴，肝细胞体积增大，肝索排列紊乱，肝血窦狭窄甚至消失；第十周、十二周模型组肝组织、肝细胞出现重度脂肪变性，肝细胞内有大量大小不等的脂滴，肝细胞体积增大，肝索排列紊乱，肝血窦狭窄甚至消失，并伴随肝细胞点状坏死和少量炎细胞的浸润。见图3。

冰冻切片苏丹三染色，第四周模型组肝组织、肝细胞出现轻度脂肪变性，肝细胞内出现少量的橘红色的脂滴，肝索、肝血窦较清晰；第六周模型组肝组织、肝细胞出现中度脂肪变性，肝细胞内出现中等量橘红色的脂滴，肝细胞体积增大，肝索排列紊乱，肝血窦狭窄甚至消失；第八周模型组肝组织、肝细胞出现重度脂肪变性，肝细胞内有大量橘红色的脂滴，肝细胞体积增大，肝索排列紊乱，肝血窦狭窄甚至消失；第十周，第十二周模型组肝组织、肝细胞出现重度脂肪变性，肝细胞内有大量大小不等的脂滴，肝细胞体积增大，肝索排列紊乱，肝血窦狭窄甚至消失，肝细胞点状坏死。见图4。

3 讨论

随着非酒精性脂肪肝的发病率逐年升高，科研工作者对该疾病的研究越来越多，如何建立与人类疾病特征相似的非酒精性脂肪肝动物模型，是研究该疾病的首要问题。建立非酒精性脂肪肝动物模型的方法很多，动物模型饲料配方有：高糖饮食，80%普通饲料＋20%蔗糖［4］；高脂饮食，在基础饲料中加入质量分数为0.01的胆固醇，0.1的猪油，0.1的蛋黄粉，0.002的胆盐［6］；改良高脂饲料，胆固醇2%，胆酸钠05%，丙硫氧哮吮0.2%，蔗糖5%，猪油10%，基础饲料82.3%［3］等。理想的动物模型应当具备以下条件：与人类疾病特征相似；病变有一定发展过程，与人类发病过程接近；形成率高，死亡率低，重复性好；造模方法简便易行［5］。本实验所采用的常规高脂饲料（88%普通饲料中加入10%猪油和2%胆固醇），配方简单，于第四周开始肝组织出现轻度的脂肪变性，成功的建立了非酒精性脂肪肝动物模型，为后续非酒精性脂肪肝的实验研究提供了坚实的基础。

［1］Farrell GC，Chitturi S，Lau GK，et al.Asia－Pacific Working Party on NAFLD.Guidelines for the assessment and management of nonalcoholic fatty liver disease in the Asia－Pacific region：executive summary［J］.JGastroenterol Hepatol，2007，22：775－777.

［2］中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南［J］.中华肝脏病杂志，2006，14（1）：161－163.

［3］王倩，管小琴.大鼠非酒精性脂肪肝造模方法的改进 ［J］.世界华人消化杂志，2007，15（11）：1219－1224.

［4］刘嵩，卢笑丛，葛建，等.高脂所致脂肪肝动物模型建立的动态研究［J］.中国药理学通报，2006，22（11）：1399－1403.

［5］苏琳，刘玉兰.高糖饮食及高脂饮食建立非酒精性脂肪肝大鼠模型的比较［M］.实验动物科学，2009，26（3）：14－17.

［6］中国卫生部.保健食品检验与评价技术规范［S］.2003：35.

Study on dynam icmorphological liver fatty liver animalmodel of nonalcoholic induced by high fat

TAN Liping1SHIAnhua2MA Jie2YAO Zheng2YIN Hua2CHENWenhui2*
1.Experimental center Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China；2.Basic Medical College of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500 China

ObjectiveThe high fat diet to establish the animalmodel of nonalcoholic fatty liver and thorough research on non alcoholic fatty liver of traditional Chinesemedicine treatment provide the basis.Methods 70 male SD ratswere random ly divided into two groups，namely the normal group（n＝20），model group（n＝50）and normalgroup were divided to five groups，4 rats in each group；model group was divided for5 groupswith 10 rats in each group.The normal group was given normal diet，model group was given conventional high fat diet.In the fourth week，sixth weeks，eighth weeks，tenth weeks，Twelfth weeks respectively 1 normal grup and 1 model grup nre excuted.Observation of rat liver grossly，weighing liverwetweight calculated rat liver body ratio，and liverwere paraffin section and he staining and frozen sectionswith Sudan IIIstaining.Results From the beginning of the fourth week，rats in themodel group liver wetweight increased，normal rats liver wet and heavy difference，and there was significant difference in the sixth week，the tenth week and the twelfth week.From the sixth weekendmodel group liver index increased significantly differencewith normal liver index contrast group.Themicroscopic appearance of liver from four appeared mild fatty liver，and with the extension ofmodelmaking，increasing.Conclusion The conventional high fat diet（88%ordinary feed adding 10%lard oil and 2%cholesterol）made the animalmodel of nonalcoholic fatty liver.Aftermodeling the around the nonalcoholic fatty liver，and with the prolongation of time increasing.

Hyperlipidemia；nonalcoholic fatty liver；model

R965.1

A

1007－8517（2015）13－0014－04

2015.05.20）

文献综述

王保芹 （1989－），男，安徽中医药大学2014级研究生，研究方向：中医药防治呼吸系统疾病。