UPLC－ELSD与UPLC－PDA测定山银花中绿原酸的含量对比

赵留存叶世芸*杨 春林昌虎郭 云赵 巡

1.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002；2.贵州理工学院，贵州 贵阳 550003；3.贵州科学院，贵州 贵阳 550001

UPLC－ELSD与UPLC－PDA测定山银花中绿原酸的含量对比

赵留存1叶世芸1*杨 春2林昌虎3郭 云1赵 巡1

1.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002；2.贵州理工学院，贵州 贵阳 550003；3.贵州科学院，贵州 贵阳 550001

目的：比较两种检测方法优劣，为丰富山银花药材质量控制方法提供参考。方法：采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1× 100mm，1.7μm）色谱柱，流动相乙腈（A）－0.4%醋酸（B），梯度洗脱（0～2 min，7%A；2～2.3 min，7%A～28%A；2.3～10 min，28%A；10～10.5min，28%A～7%A），梯度流速（0～2～2.3～2.6～2.8～4～4.3～4.5～10.5min，0.35～0.35～0.25～0.15～0.1～0.2～0.3～0.35～0.35ml／min），PDA（二极管阵列检测器）λ＝330 nm；ELSD检测器，漂移管温度60℃，喷雾器48℃，增益值100，气体流速20psi，柱温50℃。结果：PDA检测绿原酸在0.3045～1.5225μg（R2＝0.9994）质量范围内线性关系良好，ELSD检测绿原酸在0.3045～1.5225μg（R2＝0.9993）质量范围内线性关系良好。结论：PDA检测器检测时受噪音影响较小，基线较平稳，测得的数据比ELSD检测器更准确。

超高效液相色谱法；绿原酸；蒸发光检测器；二极管阵列检测器

山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.－Mazz.、红腺忍冬Lonicera confusa DC.或黄褐毛忍冬Lonicera fulvoto－mentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花［1］。灰毡毛忍冬主产湖南、重庆和贵州，红腺忍冬主产浙江、江西、福建、广西等地，黄褐毛忍冬主产贵州等地［2］。其化学成分主要含有挥发油、黄酮、有机酸和三萜类［3］，具有清热解毒、凉散风热的功效［4］。谷筱玉［5］用HPLC－UV－ELSD法、李红霞［6］用HPLC法测定山银花中绿原酸的含量，二者对山银花中绿原酸的含量测定用紫外检测器；卢凤来［7］用HPLC－ELSD法、张璐［8］用HPLC－ELSD法测定山银花中绿原酸的含量，二者用ELSD检测器对山银花中的绿原酸含量进行测定。而国内尚未见有山银花含量测定的UPLC法报道。本文用UPLC法将紫外检测器（PDA）与蒸发光检测器（ELSD）串联同时测定山银花中绿原酸的含量，并对两种检测方法进行对比，优选出了最佳测定方法，现将结果报告如下。

1 仪器和试剂

1.1 仪器 Waters UPLC H－Class超高效液相色谱仪，配有四元超高压溶剂系统、在线真空脱气机、自动进样恒温样本管理器、ELSD检测器、PDA检测器和Empower 3色谱工作站；电子分析天平 （XS20S）；超声波清洗器（HS1026OD，天津奥康）。

1.2 材料 绿原酸（批号：110753－201314，中国食品药品检定研究院）。山银花分别采自贵州绥阳县小关乡、丹寨兴仁镇、金沙龙坝乡、施秉县白垛乡和安顺西秀区，经贵阳中医学院魏升华副教授鉴定，各地山银花均为灰毡毛忍冬。乙腈为色谱纯（德国Merck）；水为哇哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。

1.3 溶液的制备

1.3.1 对照品溶液的制备 精密量取对照品绿原酸6.09mg，用50%甲醇定容至10 ml即得。

1.3.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50m l，称定重量，超声处理40min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.20μm微孔滤膜，即得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性 采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100mm，1.7μm）色谱柱，流动相乙腈（A）－0.4%醋酸（B）梯度洗脱（0～2 min，7%A；2～2.3 min， 7%A～28%A；2.3～10 min，28%A；10～10.5 min，28% A～7%A），梯度流速（0～2～2.3～2.6～2.8～4～4.3～4.5～10.5 min，0.35～0.35～0.25～0.15～0.1～0.2～0.3～0.35～0.35ml／min），漂移管温度60℃，喷雾器48℃，增益值100，气体流速20psi，柱温50℃。分别用PDA和ELSD两种检测器检测绿原酸的含量。色谱图如图1、2。

2.2 线性关系考察 将绿原酸对照品按上述色谱条件分别进样0.5、1、1.5、2、2.5μl，测定峰面积。其中紫外检测器测定绿原酸以峰面积Y对绿原酸对照品进样量X进行线性回归，而蒸发光检测器测定绿原酸以峰面积Y的对数与相对应的对照品进样量X的对数进行线性回归。不同检测器测定的线性方程见表1。

表1 绿原酸的线性方程（PDA与ELSD）

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验 取混合对照品溶液，连续进样6次，每次2μl，其中PDA检测器测得的绿原酸的峰面积RSD为0.66%，ELSD检测器测得的绿原酸峰面积的RSD为2.75%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性实验 取同一批次山银花6份，按“1.3.2”项下供试品溶液制备方法制备，按 “2.1”项下色谱条件进行测定，其中PDA检测器测得的绿原酸含量RSD为2.83%，ELSD检测器测得的绿原酸含量RSD为1.89%，表明样品重复性良好。

2.3.3 稳定性实验 取同一批供试品溶液，室温避光放置，按“1.3.2”项下供试品溶液制备方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别于0、2、4、6、8、12h进行测定，结果PDA检测器与ELSD检测器测得绿原酸的含量RSD分别为1.14%和1.61%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.4 回收率实验 精密称定已知含量的绥阳县山银花样品6份，分别加入对照品溶液17.10 mg，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，每针进样1.5μl测定峰面积，分别计算UPLC法不同检测器的回收率。结果见表2。

2.4 样品含量测定 分别取五个不同产地的山银花样品，每个样品称取三份，按 “1.3.2”项下方法制备供试品溶液，按 “2.1”项下色谱条件进样，计算含量，结果见表3。

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表3 样品含量（n＝3）

由表3可知，同一产地山银花中绿原酸的含量PDA检测器测出的含量高于ELSD检测器测出的含量，样品中绿原酸的含量越高时二者测得的数据差距就越大。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 取绿原酸对照品溶液，采用二极管陈列检测器进行全波长扫描，吸收光谱显示绿原酸在219.0、245.2、324.0 nm处有最大吸收，参考《中国药典》2010年版一部山银花的含量测定方法绿原酸的检测波长为330nm，因此本实验选取330nm作为检测波长［1］。

3.2 PDA检测器 PDA检测器是通过化合物结构中特定基团对紫外光的吸收而对化合物进行检测的检测器，具有灵敏度高、线性范围宽、使用方便、对流速和温度不敏感等优点，在液相色谱中应用非常广泛。但缺点是对无紫外吸收的化合物无法检测［9］。ELSD作为一种通用型检测器，既适用于有紫外吸收的化合物的测定，又适合于无紫外吸收的化合物的测定，其检测范围更广泛一些［10］。本文通过两种检测方式对比，两种检测器都能测出山银花中绿原酸的含量，通过实验测定的图谱分析PDA检测器检测时受噪声影响较小，基线较平稳，积分测得的数据比ELSD检测器准确，因此UPLC法测定山银花中绿原酸的含量应当用PDA检测器检测更准确一些。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典 （一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：28.

［2］肖聪颖，汪冶，田兰，等.关于 《中国药典》金银花、山银花标准的几点修订建议［J］.中国中药杂志，2011，36（10）：1406－1407.

［3］王志萍，邓家刚，王勤，等.山银花研究的最新进展 ［J］.广西中医学院学报，2008，11（4）：59－61.

［4］曹冬红，张贺文，杨科，等.高效液相色谱法测定山银花中绿原酸的含量［J］.中南药学，2007，5（1）：36－38.

［5］谷筱玉，陈振鹏，陈乾平，等.HPLC－UV－ELSD测定山银花中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量 ［J］.药物分析杂志，2011，31（5）：884－887.

［6］李红霞，王雪芹，李振国，等.不同产地金银花与山银花主要成分的含量比较［J］.中国药房，2011，22（31）：2935－2937.

［7］卢凤来，蒋海英，陈月圆，等.HPLC－ELSD法测定山银花中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙［J］.中成药，2013，35（8）：1821－1823.［8］张璐，曾文雪.HPLC－ELSD法同时测定山银花中绿原酸、木犀草苷和川续断皂苷乙的含量［J］.江西中医学院学报，2011，23（4）：40－42.

［9］陆云.高效液相色谱－紫外检测－蒸发光散射检测联用技术在中药分析中的应用研究［D］.杭州：浙江大学，2007.

［10］李中华，胡燕，刘强.两种检测器测定党参中苍术内酯III含量的比较［J］.甘肃中医学院学报，2005，22（5）：45－47.

Comparing the differences between ELSD and PDA detectors of UPLC in detem inating chlorogenic aicd in Flos Lonicerae

ZHAO Liu－cun1YE Shi－yun1*YANG Chun2LIN Chang-hu3ZHAO Xun1GUO Yun1
1.Guiyang college of Traditionnal Chinese Medicine，Guiyang 550002，China；2.Guizhou Institute of Technology，Guiyang 550003，China；3.Guizhou Academy of Sciences，Guiyang 550001，China

Objective Compare twomethods of testing，and which onewas better.Provide a reference for rich Flos Loniceramedicinalmaterials quality controlmethod.M ethods ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100mm，1.7μm）column was adopted and the temperature was 50℃.Two solution were acetonitrile（A）and 0.4%acetic acid（B），with the gradient elution of（0～2 min，A 7%；2～2.3 min，A 7%～28%；A 2.3～10 min，A 28%；10～10.5 min，A 28%～A7%），and velocity gradient（0～2～2.3～2.6～2.8～4～4.3～4.5～10.5min，0.35～0.35～0.25～0.15～0.1～0.2～0.3～0.35～0.35m l／min）.The detection waveleth was330 nm.Electronic Levelling Suspension，The temperature of drift tube wasmaintained at60℃，the temperature of nebulizer was 48℃，PMT was 100.with the nitrogen flow rate of 20 psi and column temprerature was 50℃. Results The linear response ranges of Chlorogenic Acid was 0.3045～1.5225μg（R2＝0.9994）with PDA and 0.3045～1.5225μg（R2＝0.9993）with ELSD respectively.Conclusion Photo－diode array was less about noise，more smooth about base line and more accurate about date than Evaporative Light－scattering Detector.

UPLC；ahlorogenic aicd；ELSD；PDA

R284.1

A

1007－8517（2015）01－0021－03

2014.09.29）

贵州省中药现代化重大专项项目（黔科合重大专项字（2012）6010号）。

赵留存（1984－），男（汉族），山东菏泽人，主要从事中药质量控制与新药研发。E－mail：zhaoliucun＠126.com

叶世芸（1966－），女（汉族），贵州贵阳人，教授，主要从事药物分析的研究。E－mail：lihaolora＠sina.com