家族性低钾型周期性麻痹家系的基因分析

元红花，高 宇，金银实，南光贤

（吉林大学中日联谊医院神经内二科，吉林长春130033）

家族性低钾型周期性麻痹家系的基因分析

元红花，高 宇，金银实，南光贤＊

（吉林大学中日联谊医院神经内二科，吉林长春130033）

家族性低钾型周期性麻痹（hypokalemic periodic paralysis，HPP）是常染色体显性遗传性肌肉病，是一种以发作性的迟缓性瘫痪伴血钾水平降低为特征的骨骼肌离子通道病［1］。肌无力经常累及四肢，严重者可死于呼吸肌麻痹或血清钾降低所致的心律失常［2－4］。涉及的基因有CACNA1S基因和SCN4A基因。有近90%的患者被发现在上述基因编码骨骼肌离子通道电压感受器S4片段的外显子上存在导致精氨酸替换的点突变［5］。通常由精神紧张、寒冷、感染、输入葡萄糖溶液、体温下降、代谢性碱中毒、麻醉以及应用类固醇药物等诱发，给予补钾治疗后症状可基本消失。家族性低钾型周期性麻痹的发病机制尚不明确，目前认为由上述两基因突变导致的精氨酸替换而产生的“门控漏电流”为致病的关键［6］。该电流的持续存在导致骨骼肌细胞膜静息电位稳态改变，在导致血钾降低的诱因的存在下，出现无力的发作。此外，该电流的长期作用使肌细胞内钠离子持续超载，产生细胞毒性，即使在发作间期，患者细胞也可能存在水肿和变性［7，8］。本文对一家族性低钾型周期性麻痹家系通过遗传基因分析的方法，探讨有无基因突变位点，以进一步明确病因并指导治疗。

1 资料与方法

1.1 病例资料

目标家系同一代中的6名成员，Ⅰ代夫妻二人均正常，无低钾型周期性麻痹病史。Ⅱ代中6人有3人患有低钾型周期性麻痹，均为男性。其下一代未见有低钾性周期性麻痹病例发生。该家族中患病者3人发病形式基本相同，发病年龄基本在20－40岁之间，均在劳累或体育锻炼后发病，主要累及四肢肌肉，发病前后无肌肉疼痛，未发现明显心电图异常，补钾后症状很快消失。

1.2 研究对象

同一代中的6名成员，其6人中3人患有低钾型周期性麻痹，均为男性。

1.3 基因检测

1.3.1 全血基因组提取 ①取200μl血液，加入900μl 1×STMT颠倒混匀，静置5min，12 000rpm离心2min，小心去上清。重复一次。②加入450μl Lysis Buffer A，震荡，使之分散开。③60℃水浴30 min，其间颠倒混匀数次。④加入400μl Lysis Buffer B，颠倒混匀数次。⑤离心5min，将上清转入离心柱，静置2min，离心1min，去废液。⑥使用wash Buffer A洗涤一次，Wash Buffer B洗两次，晾干乙醇。⑦加入100μl双蒸水，静置5min，12 000 rpm离心2min洗脱，管底即为基因组。

1.3.2 引物合成 根据CACNA1S外显子11、30和SCN4A外显子12序列的上下游内含子序列设计如下引物：

引物序列退火温度长度FC11TGACGAAACCCTGTCTCTATTA 62 1 027bp RC11GAGAAACCCCGTGAGAATAAGG FC30TGTGCCCAAGGATGGTCCCGAACTA 62 744bp RC30CTGGCTGGCATCCAAGCATCTGACA FS12TTTGCCTCCATCACTCACTTAT 62 633bp RS12CTCCACTGCTGCTCAAGGTCAT

引物合成后，12，000g，1min离心，用灭菌双蒸水溶解引物至终浓度10μM。

1.3.3 PCR扩增基因 反应体系：

组成体积／μL 2×Taq PCR mix 25μl F上游引物（10μM）1μl R下游引物（10μM）1μl基因组模板1μl H2O To 50μl

反应程序：

1.3.4 PCR产物纯化 ①将剩余样品点样在回收胶中，从琼脂糖凝胶中把目的条带切下，加入到灭菌离心管中，进行称重；②在胶块中加入相当于3倍凝胶体积的溶胶液A，于50℃水浴中放置10min，在水浴期间不断将离心管缓慢上下颠倒，一直到完全溶解；③将之前得到的溶液加入到一个吸附柱CA2，进行13 000rpm离心30s，丢弃废液；④再向吸附柱中加入漂洗液PW700μl，再进行13 000rpm离心30s，丢弃废液；⑤继续加入漂洗液PW500μl，给予13 000rpm离心30s，丢弃废液后，把吸附柱取出放至收集管中，进行13 000rpm离心2min。将吸附柱放置于室温中数分钟，直至彻底晾干；⑥最后把吸附柱放入到新的离心管中，悬空滴加经过70℃预热的洗脱缓冲液TE50μl，在室温中放置2min后，13 000rpm离心1min。将DNA溶液手机，直接送测序。

1.3.5 测序 纯化的PCR产物单向测序，测序引物为PCR扩增正向引物F。

2 结果

2.1 全基因组的提取

使用Whole Blood Ge－nomic DNAMin－i prep Kit血液基因组提取试剂盒提取人血液全基因组。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，各取2μl电泳检测，见图1。

图1 电泳检测结果

2.2 PCR扩增

见图2－4。

图2 FC30－1 072 bp取5μl检测结果

图3 FC30－744 bp取5μl检测结果

图4 FS12－633 bp取5μl检测

2.3 测序结果

见图5、6。

图5 测试结果中SCN4A外显子12测序图

图6 测试结果中CACAN1S外显子11测序图

3 讨论

近年来通过遗传学、分子生物学和电生理学的联合研究发现，低钾型周期性麻痹是由离子通道基因突变所致的离子通道病，涉及的离子通道基因包括编码骨骼肌电压门控钙通道α1亚单位基因（CACNA1S）和编码骨骼肌电压门控钠通道α亚单位基因（SCN4A）。1994年，Ptácek等［9］和Jurkat－Rott等几乎同时报道了本病是由于二氢吡啶受体敏感的钙离子通道（L型钙通道）α1亚基（CACNA1S）的DNA序列点突变所致。此后1999年，Bulman等在编码电压门控钠离子通道α亚单位的SCN4A基因上发现存在点突变（Arg669→His）。到目前为止，国内外研究者们在CACNA1S和SCN4A中已发现了多个突变位点。

在国内，主要有CACNA1S的R528G、R1239H、H916Q以及SCN4A的R672H／C基因突变型，分别存在于CACNA1S基因外显子11、外显子30及SCN4A外显子12上。本实验主要针对上述三段序列进行序列分析。根据CACNA1S外显子11、30和SCN4A外显子12序列的上下游内含子序列设计引物，利用PCR技术，获得目的片段并进行体外扩增，最后对所获得产物进行测序。通过家族中患者基因序列与正常家族成员基因序列及正常人基因序列相比较，明确患者是否存在基因突变以及基因突变类型。本实验最终结果为未在此家族中成员中发现有CACNA1S基因及SCN4A基因突变。分析可能的原因如下：①家族成员中患者均为散发病例；②在本实验中，仅对CACNAS1基因的30号外显子、11号外显子及SCN4A基因的12号外显子进行测序，该家族成员中患者可能存在其他基因型突变；③并不是所有的家族性患者都存在有基因突变，目前约有20%家族性低钾型周期性麻痹患者未能检测到突变基因。④也有文献报道，中国人群中CACNA1S基因和SCN4A基因的突变阳性率远低于西方白种人，提示HPP的突变基因存在种族差异；除了目前报道的突变基因外，中国人群还存在其他致病基因或导致血钾降低的因素。虽然在西方白种人中，HPP的发生原因是CACNA1S和SCN4A基因突变，但中国人群的发病原因可能与西方人群并不完全一致。因此，在此后的研究中，我们考虑需要寻找与西方白种人不同的突变基因，不能只局限于CACNA1S基因和SCN4A基因；同时可通过建立已知常见突变位点的动物模型，对其进行病理生理研究，以促进基因突变的研究。

［1］刘海玲，童晓欣.低钾型周期性麻痹的研究进展［J］.卒中与神经疾病，2010，17：306.

［2］Peng CY，Pu CQ.Clinical significance of increase of serum creatine phosphate kinase in patients with periodic paralysis［J］.Med J Chin PLA，1999，24（2）：65.

［3］Qi KL.Clinical analysis in periodic paralysis with 57cases［J］.Acta Acad Med CPAF，2011，20（8）：650.

［4］Xin SM，Zhang QF，Xin MY.Clinical analysis of hyperthyreosis Complicated hypokalemic periodic paralysis［J］.Chin J Pract Intern Med，2001，21（6）：353.

［5］Matthews E，Labrum R，Sweency MG，et al.Voltage Sensor charge loss accounts for most nases of hypalemic Periodic Paralysis［J］.Neurology，2009，72：1544.

［6］Cannon SC.Voltage－sensor mutations in channelopathies of skeletal muscle［J］.J Physiol，2010，5889（Pt 11）：1887.

［7］Jurkat－Rott K，Weber MA，Fauler M，et al.k＋－dependent paradoxical membrane depolarization and Na＋overload，major and reversible contributors to weakness by ion channelleaks［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106：4036.

［8］Jurkat－Rott K，Groowe J，Lehmann－Horn F.Pathophysiological role of omege pore current in channelopathies［J］.Front pharmacol，2013，3：112.

［9］Ptácek LJ，Tawil R，Griggs RC，et al.Dihydropyridine receptor mutations cause hypokalemic periodic paralysis［J］.Cell，1994，77.

2013－12－08）

1007－4287（2015）02－0306－04

＊通讯作者