胆汁淤积小鼠模型的探讨

张慧 卞兆连 王绮夏 廉哲雄 马雄

胆汁淤积性肝病在临床中较为常见，它可由多种原因引起，例如：肝细胞、毛细胆管、肝内胆管以及肝外胆管任何部位器质性或功能性异常，致使胆汁排泄障碍、胆汁流量减少、胆汁成分返流入血液中［1］。胆色素在肝细胞组织中蓄积，引起一系列器质性损害，导致代谢紊乱和功能异常。此状态若持续发展将导致肝小叶和血管结构破坏、结缔组织隔形成，最终肝硬化，患者预后差［2，3］。因此胆汁淤积性肝病小鼠模型的建立对于深入研究胆汁淤积性肝病具有重要意义。

资料和方法

一、实验动物

6～8周龄的SPF级雄性C57BL/6小鼠，购自中国科学院上海分院斯莱克实验动物中心。C57BL/6 dnTGF－βR II转基因小鼠由中国科学技术大学免疫学研究所廉哲雄教授惠赠。上述实验动物均于上海交通大学医学院附属仁济医院实验动物中心SPF级动物实验室内喂养。温度20～24℃，湿度50%左右，12 h光照周期单笼喂养，自由饮食和饮水。所有小鼠适应性正常饮食1周后，根据随机数字表法分组，每组10只。

二、方法

（一）BDL模型小鼠 3.5%水合氯醛腹腔内注射麻醉小鼠后，打开腹腔。显露十二指肠上段胆总管，于肝门部解剖分离肝门静脉和胆总管，剥离胆总管周围组织。造模组小鼠以6个“0”的丝线结扎胆总管后关闭腹腔。假手术对照组打开腹腔后仅解剖游离胆总管但不需将其结扎，随即关闭腹腔。所有手术操作均在无菌条件下进行，两组小鼠术后均给予普通饲料喂养，自由摄取食物和水。10 d后颈椎离断处死小鼠，取肝脏石蜡包埋行HE染色。

（二）DDC模型小鼠［4］喂养含有0.1%DDC饲料两周后颈椎离断处死小鼠，取肝脏石蜡包埋行HE染色。

（三）2OA－BSA 模型小鼠［5］称取100μg 2OABSA溶于50μL磷酸盐缓冲液（PBS）中，之后加入含H37RA结核分枝杆菌（购自美国Sigma－Aldrich，St.Louis，MO）浓度为1 mg/mL的完全弗氏佐剂50μL。上述100μL充分混匀后对小鼠进行腹腔内注射，100μL/只。初次2OA－BSA免疫当天及第3天，每只造模小鼠腹腔内注射溶于100μL PBS的百日咳毒素（含 量 100 ng，购 自 List Biological Laboratories，Campbell，CA）。第3周时再次以100μg 2OA－BSA（溶于50μL PBS），并辅以50μL不完全弗氏佐剂，对造模小鼠腹腔内注射，100μL/只。正常对照组小鼠则予以相同容积的溶剂为对照液。第8周时颈椎离断处死小鼠，取肝脏石蜡包埋行HE染色。

（四）dnTGF－βR II转 基 因 小 鼠 取 16 周 龄C57BL/6背景dnTGF－βR II转基因以及其野生对照小鼠行颈椎离断处死，取肝脏石蜡包埋行HE染色。

三、肝脏组织样品采集及处理

颈椎离断处死小鼠后迅速开腹取出肝脏，部分肝右叶组织置于4%甲醛中固定，石蜡包埋、切片，HE染色后光镜下观察汇管区以及胆管周围淋巴细胞的浸润情况，判断肝脏的组织学病变。400倍光镜下对肝组织汇管区炎性细胞进行计数。肝组织汇管区炎症分级统计标准如下：0级：汇管区无或基本无炎性细胞；1级：汇管区极少量炎性细胞浸润；2级：汇管区少量炎性细胞浸润；3级：汇管区中等程度的炎性细胞浸润；4级：汇管区扩大，大量炎性细胞浸润。

四、统计学方法

采用GraphPad Prism5.0软件处理数据及作图，汇管区淋巴细胞数以均值±标准差表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、BDL模型小鼠

模型组小鼠胆总管结扎后进食量减少，毛发散乱无光泽，少动并且对声、光刺激反应减弱，尿液逐渐呈浓茶样改变。假手术对照组无上述异常改变。肝脏大体标本BDL组小鼠肝脏明显肿大，肝包膜紧张、边缘钝、棕黄色，质稍硬。对照组则肝脏体积正常，包膜无紧张，质软，切面红润、细腻。HE染色后光镜下可见BDL组小鼠肝组织表现为肝细胞肿胀、空泡变性，出现凝固性坏死灶。汇管区及胆管周围炎性细胞浸润，胆管周围纤维化（图1A）；而对照组肝组织汇管区和胆管周围无或极少量炎性细胞浸润。小鼠汇管区炎症分级BDL模型组为（2.7±0.5）；假手术对照组为（0.0±0.0），差异有统计学意义（P＜0.01）。

二、DDC模型小鼠

随时间延长造模组小鼠出现厌食少动、反应迟缓、毛发散乱无光泽；对照组小鼠则一般情况正常。肝脏大体标本肉眼可见对照组小鼠肝脏呈粉、绛红色，表面光滑。DDC模型组小鼠肝脏肿大，色泽黄变。肝脏HE染色后光镜下显示：对照组小鼠肝组织结构正常，胆管周围无明显炎性细胞浸润，汇管区偶有散在炎性细胞浸润；而DDC模型组小鼠汇管区以及胆管周围可见大量炎性细胞浸润，胆管内胆栓形成（图1B）。小鼠汇管区炎症分级DDC模型组为（2.9±0.6）；与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

三、2OA－BSA 模型小鼠

模型组小鼠随着造模时间的延长，出现食欲减退、反应迟钝、精神萎靡。毛发粗乱、部分脱毛、二目无神。正常对照组小鼠食欲正常、反应敏捷、毛色均匀乌黑、二目有神。肝脏大体标本肉眼观：正常对照组小鼠肝脏呈粉红色或绛红色，表面光滑。2OA－BSA模型组小鼠肝脏肿大，色泽黄变，表面结构杂乱不规整。肝组织HE染色：模型组可见汇管区周围和肝内小胆管周围有大量炎性细胞浸润（图1C）；而对照组肝内胆管周围及汇管区无或极少量炎性细胞浸润。小鼠汇管区炎症分级2OA－BSA模型组为（1.5±0.5）；与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

四、dnTGF－βR II转基因小鼠

转基因组小鼠随时间延长，出现食欲减退、腹泻、体重下降、毛发粗乱、反应迟缓。野生型小鼠进食正常、反应敏捷、毛色乌亮，其肝脏外观边缘锐利，色泽红润。dnTGF－βR II组肝脏外观肿胀，包膜紧张，边缘钝厚，色泽暗红。肝脏常规病理HE染色比较：野生型小鼠肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射性排列，肝小叶结构清晰，肝细胞间联系紧密；肝细胞核大而圆，核仁明显，胞质丰富均匀；汇管区无炎性细胞浸润，结构清晰可见。而dnTGF－βR II转基因小鼠，可见汇管区和小胆管周围淋巴、浆细胞浸润，胆管上皮细胞变性坏死，基底膜不完整，小胆管增生（图1D）。小鼠汇管区炎症分级dnTGF－βR II转基因组为（1.2±0.6）；与野生型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

本研究中的小鼠肝组织汇管区炎性细胞计数显示：各对照组小鼠汇管区炎性细胞个数均很少，在0～3个之间（图1E）。

图1 各组小鼠肝组织光学显微镜下表现（HE，×200）

讨 论

胆汁淤积是由于胆汁分泌及排泄障碍引起的一种病理生理过程，长期持续的胆汁淤积将进展为肝纤维化甚至肝硬化［6，7］。建立合适的胆汁淤积性肝病小鼠模型是研究胆汁淤积发生机制、筛选护肝药物的前提，具有重要意义。尽管胆汁淤积造模方法较多，但不同物质或方法诱导胆汁淤积的机制不同，进而产生不同的病理和生化改变，各有利弊。

原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）是一种慢性胆汁淤积性肝病，好发于青壮年男性，同时累及肝内、外胆管系统。病理特点为肝内大胆管呈节段性狭窄及扩张，导致不规则的胆管闭塞，形成多病灶胆管狭窄，最终可发展为肝硬化。本研究中的BDL和DDC小鼠模型即为以肝内大胆管损伤为特征的PSC动物模型。

BDL小鼠模型结扎小鼠胆总管后，随时间延长肝脏对称性肿大，出现胆汁淤积表现。本研究中采用胆总管结扎法造成小鼠肝外胆道梗阻，进而肝细胞缺血和坏死，建立胆汁淤积动物模型。此模型建立时间相对较短，术后10 d即可在光镜下见轻度肝细胞肿胀、空泡变性，汇管区及大胆管周围炎性细胞浸润、胆管周围纤维化。考虑到手术应激、肝脏牵拉、甚至麻醉药物的应用都会造成肝细胞损伤，因此在此组实验设计中设置假手术对照组以观察上述原因对肝组织的影响。光镜下可见假手术对照组小鼠肝脏小叶结构清晰，肝细胞索由中央静脉向四周呈放射状排列，中央静脉、汇管区动、静脉和胆管结构正常。肝窦不扩张，肝组织汇管区和胆管周围无或极少量炎性细胞浸润。两组小鼠汇管区炎症分级差异有统计学意义。胆管梗阻时，肝脏实际上呈缺血状态。毛细胆管进行性扩张，可形成小囊，微绒毛数量明显减少或消失。肝细胞向肝血窦伸出微绒毛，阻塞血流。肝细胞和肝内巨噬细胞中出现胆色素颗粒沉积，肝内炎性单核吞噬细胞分泌Ly－6C和CD11b以及大量炎性因子［8］。胆管阻塞时，肝脏病理改变最明显处为门管区，小叶间胆管增生，伴胆管周围纤维化。增生胆管有很窄的管腔，不断被胶原纤维包绕，最终导致肝硬化［9］。

已知外源物质和药物可能导致胆管发生病理性改变，出现胆管纤维化。毒素可直接干扰肝细胞和/或胆管上皮细胞及其分子水平机制，通过影响相关基因（Ntcp，Oatp4，Mdr2，Mrp2，Mrp3，Mrp4等）表达的上调和/或下调、阻断生长因子与受体结合、蛋白合成、炎性反应损害细胞膜和/或激活非实质细胞等起作用［10－14］。以往文献显示，喂养小鼠以 DDC后可使之胆卟啉分泌增加，诱导胆管上皮细胞表达血管细胞黏附分子、骨桥蛋白和肿瘤坏死因子α。同时，肝组织内CD11b阳性细胞、胆管损伤、胆管周围成纤维细胞活化显著增加并伴以严重的胆管周围炎。随着造模时间的延长，小鼠谷胱甘肽和磷脂的分泌显著下降。出现胆管周围炎、管周纤维化、相邻门管区桥接样炎症，节段性胆管梗阻。本研究2周DDC小鼠造模组光镜下肝细胞内可见胆色素沉积，胆管内胆汁淤积。上述结果表明，已成功建立DDC喂养诱导法的胆汁淤积性小鼠模型。

原发性胆汁性肝硬化是一种慢性胆汁淤积性肝病，中老年女性患者多见，血清碱性磷酸酶和γ－谷氨酰转肽酶水平显著升高，免疫球蛋白IgM升高。约90%～95%的PBC患者血清抗线粒体抗体（antimitochondria antibody，AMA）阳性，以免疫介导的肝内小叶间胆管炎损伤为病理学特征。PBC的病变特征即是肝内汇管区大量的淋巴细胞浸润，自身反应性T细胞不断破坏小胆管上皮细胞，导致胆管逐渐减少，胆汁淤积并最终引起进行性的肝脏损伤［15］。目前建立的PBC动物模型包括自发性模型、药物诱导模型、抗原接种模型、细胞接种模型和基因缺陷模型［16－18］。

本研究中的2OA－BSA小鼠模型和dnTGFβR II转基因小鼠均属于以胆汁淤积为疾病特征的PBC动物模型。Wakabayashi等［5］在C57BL/6小鼠中以外源性物质2OA－BSA辅以完全弗氏佐剂腹腔内注射免疫造模并观察至24周。该研究显示，造模小鼠出现自身免疫性胆管炎、血清AMA阳性、肝组织内浸润的淋巴细胞数量增加，后者尤指共表达CD44的CD8＋T细胞。血清肿瘤坏死因子α、干扰素γ等细胞因子增加。本研究中的2OA－BSA小鼠肝组织可见汇管区周围和肝内小胆管周围有大量炎性细胞浸润；而对照组肝内胆管周围及汇管区无或极少量炎性细胞浸润。两组小鼠汇管区炎症分级差异有统计学意义。

显性阴性转移生长因子β受体II（dnTGFβR II）小鼠属于基因缺陷PBC小鼠模型，其血清AMA阳性率100%［19］。本研究中观察了dnTGFβR II转基因及其野生对照型小鼠16周龄时肝脏病理组织学HE染色的变化。光镜下观察可见，野生对照组肝小叶完整，肝细胞排列整齐，未见明显肝实质细胞病变，中央静脉和汇管区结构正常。而dnTGFβR II转基因组肝小叶轮廓不清，汇管区有大量淋巴、浆细胞浸润，肝细胞肿大、胞质疏松，有的呈气球样变及嗜酸样变，可见明显点状或灶性坏死（图1D）。两组小鼠汇管区炎症分级差异有统计学意义。

已知TGF－β在细胞的增殖、分化、迁移过程中以及癌变、纤维化、创伤愈合、免疫反应中有重要作用［20－23］。同时，该细胞因子对 T、B、NK、巨噬细胞和树突状细胞有抑制作用。肝脏纤维化时，TGF－β起着重要作用。目前认为导致细胞外基质蛋白沉积增加的最主要细胞族是肝星形细胞（hepatic stellate cels，HSC），HSC通过旁分泌、自分泌途径增加TGF－β生成。TGF－β继而又参与HSC活化，导致细胞外基质蛋白生成增多、降解减少，发生肝纤维化［24］。dnTGF－βR II转基因小鼠是由CD4启动子控制的TGF－β受体Ⅱ显性负相过度表达C57BL小鼠，因特异性损伤CD4启动子处的TGF－βII型受体，导致其外周免疫耐受被影响。该小鼠能自发形成PBC，出现类似PBC患者的表现，包括：血清AMA/M2阳性，类似PBC肝脏病理及细胞因子谱的改变等。模型发病年龄为5～6周，组织病理显示肝脏门脉区浸润的炎性细胞和人类PBC非常相似。两者均存在特异性的小胆管损伤、肝纤维化，肝脏浸润的T细胞中CD4＋T细胞活化，活化CD4＋T细胞针对的靶抗原为丙酮酸脱氢酸复合体E2亚基，NKT细胞比例增加，血清免疫球蛋白水平上升，产生针对PDC－E2、2－酮戊二酸脱氢酶E2亚基和支链2－酮酸脱氢酶E2亚基的AMA，有ANA产生，以及血清IL－12、IL－6、肿瘤坏死因子α、干扰素γ等细胞因子增加［25］。TGF－β促进FoxP3＋调节性T细胞（Treg）的形成。有报道显示PBC患者外周Treg水平降低［26，27］。TGF－β调节 Treg的 FoxP3表达，TGF－βII型受体受损，导致机体对肝脏自身蛋白免疫耐受的缺失，诱发自身免疫性疾病。上述模型的建立有助于阐明PBC发病机制，促进PBC早期诊断和治疗研究的进一步深入。

胆汁淤积是多种肝脏疾病过程中常见的病理改变，表现为正常胆汁流被损害或阻断，胆汁酸和其他有害物质过度蓄积而引发肝损伤。本研究所建立的四种胆汁淤积小鼠模型造模方法简单、周期短，形成胆汁淤积稳定可靠。其中，BDL和DDC模型以大胆管损伤为主；2OA－BSA模型和dnTGF－βR II转基因小鼠模型以小胆管损伤为主。实验中均无对动物和人有毒物的物质接触。因此，上述模型是研究胆汁淤积发病机制和寻找治疗药物研究的理想模型。

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