蜂王浆中四环素类药物残留量的测定方法研究

叶有标 祝子铜 章应俊 刘国群

摘 要：采用液相色谱-质谱联用技术，建立测定不同状态的蜂王浆中4种四环素族抗生素残留量的测定方法。蜂王浆样品试样中四环素族药物残留量用0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取，经过滤和离心后，上清液用PLS固相萃取柱净化，液相色谱串联质谱仪测定，外标峰面积法定量。4种药物基本实现分离以及定性定量。蜂王浆中四环素药物残留的测定低限（LOQ）为10 μg/kg，线性范围为10～50ng/mL。回收率均在88.0%～102.0%之间，相对标准偏差（RSD）不大于20%。土霉素、四环素，金霉素、强力霉素的检测限为10μg/kg。该方法灵敏、可靠，可用于不同状态蜂王浆中4种四环素类抗生素的同时检测。

关键词：液相色谱-质谱联用技术 蜂王浆 四环素类抗生素

中图分类号：R9781 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2015）03（c）-0018-01

该文采用高效液相色谱法和高效液相串联质谱法对不同状态的蜂王浆的检测分析技术研究，期建立一种能符合对不同状态的蜂王浆的检测的技术，确保测试结果准确性。为蜂产品检测四环素类抗生素提供技术支持。通过系列实验结果表明，该方法能满足蜂王浆产品检测需求。

1 实验部分

1.1 安全提示

本方法在样品处理时，应戴上防护手套避免甲醇、甲酸对身体的伤害。若溅到皮肤和眼睛，应立即用大量清水冲洗，情况严重者应尽快到医院治疗。

1.2 仪器和设备

Agilent 1200高效液相色谱-串联质谱联用仪，配有电喷雾（ESI）离子源、涡旋振荡器、离心机：转速≥4000 r/min、聚丙烯具塞塑料离心管：50 mL、

分析天平：感量0.0001 g、移液枪：50 μL、200 μL、1000 μL、一次性滴管、固相萃取装置、玻璃离心管：10 mL、氮吹仪、微孔滤膜，0.45 μm、0.2 μm、PH计。

1.3 试剂与材料

有机溶剂为HPLC级、乙二胺四乙酸二钠等为分析纯、流动相HPLC级。

1.4 原理

试样中四环素族药物残留量用0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取，经过滤和离心后，上清液用PLS固相萃取柱净化，液相色谱串联质谱仪测定，外标峰面积法定量。

2 试样

（1）试样制备将抽取的样品充分混匀，均分成两份，分别装入洁净的容器中，密封、标记、-18℃冷冻保存，以备测试。

（2）提取：称取试样2 g（精确至0.01g），置于50 mL具塞塑料离心管，加入浓度为100 ng/mL的混合内标标准溶液100 μL，在加標样品中加入浓度为100 ng/mL的混合标准溶液100 μL，加入5 mL0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液和5mL甲醇漩涡混合1min，6000r/min离心5 min，合并上清液与50 mL容量瓶中，再分两次用约10 mL0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液冰水超声提取两次，每次漩涡混合1 min，6000 r/min离心5 min，合并上清液，并定容至50 mL，混匀，取25 mL溶液至离心管用PH计调节pH至6.0。

（3）净化：将上述样品溶液加至已活化的PLS柱，待样液完全流出后，依次用6 mL水和6 mL甲醇：水（1：19）淋洗，弃去全部流出液。2.0 kPa以下减压抽干5min，最后用10 mL甲醇洗脱。将洗脱液氮吹浓缩至干（温度低于40 ℃），用1.0 mL甲醇：水=1：9（含0.15%甲酸）溶解残渣，过0.45 um滤膜，待测定。

3 仪器参数与测定条件

3.1 色谱测定条件

（1）色谱柱：Eclipse Plus C18， 3.5μm，2.1×100 mm（内径）。（2）梯度洗脱条件。（3）流速：0.25 mL/min。（4）进样量：20 μL。（5）柱温：40℃f）流动相：A：0.3%甲酸 B：乙腈表 梯度洗脱条件。

3.2 定量方法

用色谱工作站建立标准工作曲线，样品采用工作曲线定量。

3.3 样品加标回收率实验

蜂王浆中四环素测定的回收率范围和精密度（n=6检测限、测定低限、线性范围、回收率范围和精密度。本方法对于蜂王浆中四环素药物残留的测定低限（LOQ）为10 μg/kg，线性范围为10～50.0 ng/mL。

4 结果计算

按式（1）计算试样中含量。

（1）

式中：

X—试样中的残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

C—由标准工作曲线得到样液中的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V—样液最终体积，单位为毫升（mL）；

m—最终样液所代表的试样量，单位为克（g）。

4.1 检测质量控制标准

质控样品为空白样品添加，添加水平为0.5 μg/kg，回收率范围为80%～110%。标准工作溶液线性范围为4～50.0 μg/mL，相关系数大于0.88。称取5g（精确到0.01 g）蜂王浆空白样品，加入浓度100 ng/mL的混合标准溶液200 μL，按照上述实验方法，测定添加样品中四环素的含量。空白溶液及其添加50 μg/kg标准溶液所得色谱图。

5 结论

针对不同状态的蜂王浆（干粉和鲜王浆）采用高效液相色谱法和高效液相串联质谱法对四环素类抗生素检测，得出如下结论。

该方法可以用于干粉和鲜王浆中四环素类抗生素及代谢物检测，回收率88.0%～102.0%，目标代谢物有良好的回收率。

对不同状态的蜂王浆的检测，本方法对于蜂王浆中四环素药物残留的测定低限（LOQ）为10 μg/kg，线性范围为10 μg/mL～50.0 μg/mL，符合产品质量安全标准要求。

该方法具有较高灵敏度，适用相对较广，检测时间，前处理简便。

参考文献

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[2] GDFB 234-2004动物源性食品中四环素族残留量的检验方法高效液相色谱法[S].2004.

[3] GB/T 20764-2006可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量测定液相色谱-紫外检测法[S].2006.