β-葡萄糖苷酶体外分子改造研究进展

刘 震， 朱秋享， 石贤爱, 2， 彭永辉， 陈荫楠

(1. 福州大学生物科学与工程学院， 福建 福州 350116； 2. 福建省医疗器械和医药技术重点实验室， 福建 福州 350002)

β-葡萄糖苷酶体外分子改造研究进展

刘 震1， 朱秋享1， 石贤爱1, 2， 彭永辉1， 陈荫楠1

(1. 福州大学生物科学与工程学院， 福建 福州 350116； 2. 福建省医疗器械和医药技术重点实验室， 福建 福州 350002)

β-葡萄糖苷酶是纤维素酶的重要成分之一， 负责纤维素的最终降解， 在畜牧生产、 食品行业、 能源和医疗卫生等领域都有重要应用. 天然来源的β-葡萄糖苷酶表达水平低、 分离纯化困难， 阻碍了β-葡萄糖苷酶的进一步应用. 利用蛋白质工程技术对β-葡萄糖苷酶进行体外改造， 提高其糖苷水解或者低聚糖苷合成活性， 是β-葡萄糖苷酶研究及应用的趋势. 就β-葡萄糖苷酶体外分子改造的研究进展及成果进行综述， 比较不同分子改造策略的特点， 总结β-葡萄糖苷酶分子改造过程中的一般规律， 展望β-葡萄糖苷酶分子改造的研究及发展方向， 为微生物来源的β-葡萄糖苷酶的体外分子改造研究提供参考.

β-葡萄糖苷酶； 定点突变； 定向进化； 半理性设计

0 引言

β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)可水解β-葡萄糖苷的非还原端并释放出β-D-葡萄糖和糖基配体. 天然β-葡萄糖苷酶多以同多聚体的形态发挥作用， 其中原核生物中以四聚体居多， 真核生物中以二聚体居多.β-葡萄糖苷酶来源十分广泛， 包括古细菌、 细菌、 真菌、 植物和动物等各类物种[1]， 其中植物来源的天然β-葡萄糖苷酶糖苷水解活性最高， 最适催化温度较高， 在工业生产中应用最多， 但科学研究中使用最多的是细菌来源的酶. 原核生物来源的β-葡萄糖苷酶易于获取但酶活不高， 而真核生物来源的β-葡萄糖苷酶成分复杂， 难以分离纯化， 这使得普通的发酵工艺及提纯方法难以获得较高产量性质优秀的β-葡萄糖苷酶， 从而大大限制了β-葡萄糖苷酶在工业生产中的应用.

体外分子改造可以改变酶的一系列特性， 从而获得某一酶学性质提高的突变体. 目前利用该技术改善β-葡萄糖苷酶的酶学特性已有较多报道. 虽然对β-葡萄糖苷酶的分子改造取得了许多成果， 但离适合工业生产的重组酶还有很大差距.

1 β-葡萄糖苷酶的家族信息与功能结构

1.1 β-葡萄糖苷酶的家族分类及进化特征

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)属于糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase families, EC 3.2.1.X)， 该家族包括133个子家族， 共有185个糖苷水解酶成员， 其中β-葡萄糖苷酶分布于GH家族1、 3、 5、 9、 30和116[2-3]中.β-葡萄糖苷酶除了能够水解β-葡萄糖苷， 还能够水解β-半乳糖苷， 有些酶甚至能水解木糖苷、 果糖苷等多种糖苷， 此外它还具有直接糖基化和转糖苷活性， 在低聚寡糖和糖苷合成中具有重要作用.

不同来源的β-葡萄糖苷酶， 其序列一致性有很大的差距. 利用MEGA5软件构建不同物种β-葡萄糖苷酶的系统进化树(见图 1)， 可以发现随着时间的推移，β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列已经发生巨大的变化，β-葡萄糖苷酶的进化距离与物种之间的亲缘关系基本保持一致. 然而， 即使是同源性极低的β-葡萄糖苷酶， 执行催化功能的活性中心仍保持了高度的相似性. 通过Uniprot/Align进行多重序列比对， 发现芽孢杆菌属的β-葡萄糖苷酶蛋白序列有两个高度保守序列， 靠近N端的-T-L-Y-H-W-D-L-P-和靠近C端的-[IV]-T-E-N-G-(见图2)， 这对芽孢杆菌属β-葡萄糖苷酶的人工进化和分子改造具有重要意义.

图 1 不同物种来源的β-葡萄糖苷酶的系统发生树Fig.1 Phylogenetic tree of β-glucosidase from different species

图2 芽孢杆菌属β-葡萄糖苷酶的序列比对Fig.2 Sequence alignment of β-glucosidase from Bacillus

1.2 β-葡萄糖苷酶的功能结构及催化机制

不同家族的β-葡萄糖苷酶有不同的蛋白构象. 家族l、 5、 30的β-葡萄糖苷酶的主要结构是(α/β)8桶， 该结构是糖苷水解酶家族中最典型的结构域之一， 能够专一性地催化糖苷键的水解，β-葡萄糖苷酶的活性中心就处于该结构域中； 家族3的β-葡萄糖苷酶则是由A、 B两个结构域组成， A区靠近N端， 内有质子供体Glu， B区位于底物结合口袋， 包括SDWG保守序列， 内有亲核基团Asp； 家族9的β-葡萄糖苷酶有6个(α/α)螺旋结构； 家族116的β-葡萄糖苷酶是最近才提出的分类[4]， 还未见到该家族的酶三维结构方面的研究报道. 蛋白构象的不同， 导致它们的酶学性质各异. 家族1的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶与家族1的β-葡萄糖苷酶的三维结构十分相似， 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶大多是热稳性酶， 具有极高的耐热性， 然而多数家族1的β-葡萄糖苷酶热稳定性却不好. 通过文献报道不难发现， 两种酶都具有(α/β)8桶结构域， 但6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的三维结构中比β-葡萄糖苷酶有更多的α/β环结构[5-7]. 表1列出了不同家族β-葡萄糖苷酶的序列信息、 3D结构、 催化机制及其它信息.

表1 β-葡萄糖苷酶的家族分类及其在数据库中的信息统计*

注： *表中数据统计截止于2014年5月； -表示在数据库中没有记录.

虽然β-葡萄糖苷酶的序列千差万别， 结构复杂多变， 但对其催化机制的看法还比较统一. 公认的活性位点关键残基是靠近N端和C端的两个Glu残基. 前者作为质子供体， 后者作为亲核试剂(家族3以Asp为亲核试剂). 按照异头碳在反应前后是否发生立体构型变化， 催化反应分为反转型和保留型两种机制. 除了家族9是反转型外， 其他家族基本都采用保留型. 两种催化机制都涉及氧碳鎓正离子过渡态的形成. 反转型催化采用单取代广义酸催化机制， 从过渡态直接释放α-D-葡萄糖产物； 保留型催化采用双取代广义酸催化机制， 从过渡态形成糖-酶共价中间体(E-S)， 最后释放β-D-葡萄糖. Withers等[8]利用2, 4-二硝基苯基-2-脱氧-2-氟代糖苷共价标记， 第一次证明了这种共价中间体的存在， 为保留型β-葡萄糖苷酶的催化机制提供了证据.

2 β-葡萄糖苷酶的分子改造

β-葡萄糖苷酶的体外分子改造大体经历了三个阶段： ① 理性设计阶段， 其代表是“定点突变”； ② 以“定向进化”技术主导的非理性设计阶段； ③ 基于序列和结构数据信息的半理性设计阶段， 其特点是将理性设计与定向进化结合起来.

2.1 定点突变

定点突变是指通过编码基因的突变对蛋白质氨基酸进行替换、 增加或删除， 获得性质发生改变的突变体酶.β-葡萄糖苷酶活性中心的关键残基， 正是通过定点突变技术确定的. 对土壤杆菌(Agrobacteriumsp.)β-葡萄糖苷酶活性位点Glu358进行定点突变后， 结果E358N、 E358Q完全失活， E358D活力比天然酶降低2 500倍， 实验利用巧妙的安排进一步证明Glu358对底物结合几乎没有影响， 而对过渡态的稳定十分重要， 从而证明了Glu358是该酶的亲核试剂[9]. Voorhorst等[10]在研究极端嗜热的强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)β-葡萄糖苷酶的过程中， 发现对Glu372的替换导致酶活降低， 这表明Glu372是这种耐高温β-葡萄糖苷酶的催化活性中心的关键残基. 远古时代的古细菌与进化至今的细菌具有相同的亲核催化位点， 这说明β-葡萄糖苷酶亲核催化中心残基在进化过程中具有十分严格的保守性.

Liu等[11]从中国南海生物宏基因组中分离到的Bgl1B， 然后进行H184F和L409E突变， H184F的葡萄糖耐受性提高十几倍； Hansson等[12]将强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的β-葡萄糖苷酶进行定点突变， 结果M424K和F426Y两个突变体的转糖苷酶活有显著提高. Sun等[13]对来源于海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的热稳性β-葡萄糖苷酶进行定点突变， 突变体的催化效率提高2.2倍. Mackenzie等[14-16]通过对土壤杆菌(Agrobacteriumsp.)β-葡萄糖苷酶亲核试剂Glu358一系列的突变， 最终将该酶的糖苷合成催化效率提高1 350倍， 其被称为“分子改造糖苷合成酶”. 不过， 由于该酶必须使用氟代糖和芳基糖分别作为糖基供体和受体， 这种分子改造糖苷合成酶始终没有在功能寡糖的合成中取得广泛应用.

Lee等[17]在单氨基酸突变的基础上做了改进， 构建了同时含有两个或三个残基替换的突变体， 其中突变体P172L/F250A在催化效率和热稳性方面都比单突变体更优秀. 这表明了定点突变从单突变体向小型突变体库的发展趋势， 这使定点突变能更有效、 更广泛地应用在β-葡萄糖苷酶的分子改造中.

2.2 定向进化

定向进化又称体外分子进化， 它无需知道酶的三维结构及功能机理， 即可通过对编码基因的随机突变和基因重组构建突变体库， 再与高通量筛选技术相结合， 最终获得具有优良性质的突变体酶. 定向进化弥补了定点突变的主要缺陷， 它不再只是专注于如何产生有效的突变体， 而是把重点放在如何筛选有效的突变体上. 在过去十几年里， 定向进化展现了其在β-葡萄糖苷酶分子改造中的巨大作用， 部分实例见表2.

表2 利用定向进化技术成功改造β-葡萄糖苷酶的部分实例

与定点突变的“所变即所得”不同， 定向进化的基本规则是“所筛即所得”， 定向进化的成功与否就在于筛选庞大的突变体文库. 定向进化的突变体库容量可达1012～ 1015， 而实际上筛选10万个以上克隆子的报道都不多见. 近些年来出现了一些新的筛选方法， 大大提高了β-葡萄糖苷酶突变文库的筛选通量. Rakic[27]和Kittl[28]在报道中都提到了针对糖苷合成活性定向进化的高通量筛选方法： 融合蛋白共表达的琼脂平板筛选技术； 高通量的“化学互补”筛选方法； 基于氢氟酸导致的pH变化的分光光度法； 由Wither改进的荧光激活流式细胞筛选技术和由Thorson改进的荧光筛选法. David等[29]利用甲基红来监视释放的氢氟酸导致的pH变化， 成功从嗜热杆菌β-木糖苷酶突变体(E335G)糖苷合成酶易错突变体库， 筛选出了糖苷合成活性提高的随机突变体. 此外， 还有一些表面展示技术， 如细胞表面展示、 噬菌体展示、 核糖体展示技术等[30-31]， 为更高效、 高通量的筛选提供了可能.

对于定向进化技术， 只要突变体库足够大， 就有可能包括各种性质发生变化的突变体， 但是， 突变体库越庞大就越需要高效、 高通量的筛选方法. 构建高质量、 功能丰富的小型库， 可以降低筛选的压力， 反而可能取得更好的进化结果. 这种需求也加速了理性设计与定向进化结合的进程， 使基于数据驱动与结构信息的半理性设计开始崭露头角.

2.3 半理性设计

半理性设计， 也称为数据驱动设计， 是最近几年才提出的一种新蛋白质工程策略. 随着生物信息学的迅猛发展， 各大数据库中收录的糖苷酶基因和蛋白信息呈现爆炸式增长， 这些庞大的数据催生了基于糖苷酶序列和功能结构信息的新型改造策略， 即糖苷酶的半理性设计. 其特点是在分析比较各类数据的基础上， 通过一定的计算模拟与预测指导糖苷酶的改造， 侧重于构建高质量的小型突变体库， 降低高通量筛选的压力.

这种“半理性”设计策略， 通常利用蛋白质序列信息， 结构与功能信息， 以及计算机预测算法预选潜在的靶位点， 并限制氨基酸多样性. 这种专注于特定氨基酸替换的建库方法， 考虑了进化变异、 拓扑结构约束、 催化机制特征， 来权衡用哪一种氨基酸进行替代， 这样虽然大幅降低了库的大小， 却可能导致功能更多的库. 另外， 基于序列和结构的设计策略， 如QM和MD算法以及机器学习算法， 已经成为有效探索关键氨基酸对蛋白质结构和稳定性影响的宝贵工具[32]. 这些策略不仅为通过酶的重新设计改变蛋白质的功能提供了帮助， 还为通过酶的从头设计创造新的功能奠定了基础.

从实用的角度来看， 半理性蛋白质工程可以显著提高生物催化剂改造的工作效率. 除了不再需要反复突变来获取所需的表型， 产生高质量的小突变库也可以有效地消除高通量筛选的困难. 最后， 这些设计策略为预测和合理化实验数据提供了一个知识框架， 使蛋白质工程领域从基于探索转变到基于假说.

现在， 已经有多种针对蛋白质空间结构优化的理性设计算法， 其中比较突出的是SCHEMA、 ProSAR和ROSETTA[33]. Fox等[34]用ProSAR算法指导了一个细菌卤代醇脱卤素酶的定向进化， 使氰化工序的体积产率提高了约4 000倍， 达到了商业性生物催化工序设计标准的要求. 目前， 已有利用这些算法指导糖苷酶分子改造的实例[35-36]， 但这些算法还未直接应用于β-葡萄糖苷酶的改造.

3 结语

到目前为止， 还没有明确的理论基础用于指导β-葡萄糖苷酶的改造， 但是从大量的研究事实中可以发现一定的规律： ① 导致β-葡萄糖苷酶热稳定性提高的位点一般远离活性中心， 充当重要角色的多是位于肽链转折点的疏水性芳香残基； ② 导致水解活性提高的突变位点一般都不是催化活性中心， 而是在底物结合、 热稳定性、 空间定位等方面有重要作用的关键位点； ③ 对活性中心的突变， 尤其是功能残基及邻近残基的突变， 会提高糖苷合成活性或者改变底物谱.

定点突变技术从出现至今， 经历不断的改进， 取得了许多卓越的成就， 随着新型设计策略的崛起和发展， 定点突变将在β-葡萄糖苷酶分子改造中继续发挥重要作用. 定向进化是目前β-葡萄糖苷酶分子改造的主要手段， 出现于理性设计之后， 但取得了更加丰硕的成果. 定向进化允许构建超大容量的突变体库， 但它没有突破筛选瓶颈， 严重阻碍了自身发展. 如果说理性设计以获取突变体见长， 非理性设计以筛选见长， 那么半理性设计则是融合了这两种策略的长处， 将成为未来β-葡萄糖苷酶分子改造的重要手段. 一方面， 随着基因技术、 蛋白质结构信息学的发展， 完全有可能设计并构建出功能更全的小突变体库； 另一方面， 随着高通量筛选技术的迅速发展， 快速高效地进行大规模筛选也有可能实现，β-葡萄糖苷酶的体外分子改造充满希望.

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(责任编辑： 洪江星)

Development in molecular modification ofβ-glucosidaseinvitro

LIU Zhen1， ZHU Qiuxiang1， SHI Xian’ai1, 2， PENG Yonghui1， CHEN Yinnan1

(1. College of Biological Science and Technology, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116, China;2. Fujian Key Lab of Medical Instrument and Pharmaceutical Technology, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Beta-glucosidases are the important members of cellulases, which are responsible for the final step in natural degradation of cellulose. They are widely applied in livestock industry, food industry, as well as energy, health and other fields. However, the low expression level or difficult to separate and purify ofβ-glucosidase, seriously impeded the nativeβ-glucosidase for further applications. Using protein engineering techniques to modify the enzymeinvitroand subsequently to obtain some excellent qualities, especially in improving the glucoside hydrolytic activity or oligosaccharide synthesis activity, is the trends in the study ofβ-glucosidase. This paper make an overview on the researches and achievements in molecular modificationinvitroofβ-glucosidase. The characteristics of different molecular modification strategies and summarize the general laws inβ-glucosidase molecular modification process are compared. Research and development needs are outlooked. This summarization provides reference to studies of microbialβ-glucosidase molecular modificationinvitro.

β-glucosidase； site-directed mutagenesis； directed evolution； semi-rational design

10.7631/issn.1000-2243.2015.04.0565

1000-2243(2015)04-0565-07

2014-05-09

石贤爱(1971- )， 博士， 教授， 主要从事酶定向进化与改造、 生物催化与生物转化及生物活性物质分离与表征等方面的研究， shixa@fzu.edu.cn

国家海洋公益性行业科研专项子课题(201205022-3)； 福建省科技重大专项资助项目(2013NZ0003)

Q816

A