硫化氢对老龄急性脑梗死大鼠海马CA3区突触结构的影响

郭丹丹，章以杰，刘志成，常国江，林 俊，田苗苗，宋晓丽

硫化氢对老龄急性脑梗死大鼠海马CA3区突触结构的影响

郭丹丹，章以杰*，刘志成，常国江，林 俊，田苗苗，宋晓丽

目的 评价硫化氢(H2S)对老龄急性脑梗死大鼠海马CA3区突触结构的影响。方法 健康雄性SD大鼠60只，18～20月龄，体重500～700 g，采用随机数字表法分为4组，每组15只：对照组(C组)、模型组(M组)、NaHS 组(N组)、生理盐水组(S组)。N组于制作模型前25 min给予大鼠腹腔注射H2S外源性供体NaHS(28 μmol/kg)；S组于制作模型前25 min给予大鼠腹腔注射等量生理盐水；C组不行任何处理。采用线栓法致大鼠大脑中动脉阻塞致急性脑梗死模型。于急性脑梗死后第1～5天每组随机取5只大鼠，进行Morris水迷宫进行测试，记录逃避潜伏期和穿越平台次数；于急性脑梗死后1、3、5 d(T1～T3)每组随机取5只大鼠处死，取海马组织，电镜下定量测定海马CA3区突触结构各项指标。结果 与C组比较，M组、N组和S组大鼠急性脑梗死后逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少，海马CA3区突触数减少，间隙增宽，突触后膜致密物厚度变薄，突触活性区长度缩短，突触界面曲率减小(P<0.05)；与M组比较，N组急性脑梗死后逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多，海马CA3区突触数增加，间隙变窄，突触后膜致密物厚度变厚，突触活性区长度延长，突触界面曲率增大(P<0.05)；与N组比较，S组急性脑梗死后逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少，海马CA3区突触数减少，间隙增宽，突触后膜致密物厚度变薄，突触活性区长度缩短，突触界面曲率减小(P<0.05)。结论 H2S可改善老龄急性脑梗死大鼠认知功能，其机制可能与海马组织CA3区突触结构改变有关。

硫化氢；认知功能；急性脑梗死；海马；突触

0 引言

急性脑梗死已成为世界上主要的致死疾病之一，认知功能障碍是幸存者最常见的并发症，有研究显示，急性脑梗死后1周时，认知功能障碍的发生率为61%，6个月时仍有37%的患者遗留认知功能障碍[1]。因此，在脑梗死早期，注重患者认知功能的恢复，对患者改善生活质量有重要意义。硫化氢(H2S)是继发现一氧化氮和一氧化碳之后研究者发现的第三种气体信号分子[2]。近年来，该分子在哺乳动物各系统中的生理、病理调节作用受到人们重视。大量研究表明，血清H2S水平降低可能与脑梗死临床病情严重性及脑动脉血管病变程度相关[3-4]。突触是神经元之间传递信息的重要结构，海马不同区域的功能不尽相同，其中CA3区在学习记忆中起重要作用[5]。本研究拟评价H2S对老龄急性脑梗死大鼠海马CA3区突触结构的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠(青岛大学实验动物科学部提供)75只，月龄18～20个月，体重500～700 g，采用随机数字表分为4组：对照组(C组)、模型组(M组)、NaHS 组(N组)和生理盐水组(S组)，每组15只。参照文献[6]采用线栓法致大鼠大脑中动脉阻塞致急性脑梗死模型。N组于制作模型前25 min，给予大鼠腹腔注射H2S外源性供体NaHS(28 μmol/kg)；S组于制作模型前25 min，给予大鼠腹腔注射等量的生理盐水；C组不行任何处理。

1.2 方法 采用Morris水迷宫进行测试：制作模型前1 d，大鼠自由游泳2 min以适应环境，剔除有明显运动障碍的大鼠。于急性脑梗死后第1天进行观察，连续5 d，每天上午进行实验。分别从4个象限的池壁中点将大鼠面向池壁放入池中，记录其在120 s内寻找到平台的时间即为逃避潜伏期，取4个象限的时间平均值及穿越平台次数作为当日学习记忆成绩。若大鼠在120 s内不能上台，引导其登上平台并停留30 s，此时逃避潜伏期记为120 s。最后一次获得性训练结束后的第1天，撤除平台，将动物由原先平台象限面向池壁放入水中，记录大鼠在120 s内穿越原先平台所在位置的次数，以此作为空间记忆的检测指标。

分别于制作模型后1、3、5 d(T1～T3)时，每组随机取5只大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉下，开胸，暴露心脏，经升主动脉依次灌注4%多聚甲醛和生理盐水，取右侧海马组织，置于2.5%戊二醛中固定，4 ℃过夜。用振动切片机垂直于海马长轴平断面切片，参照鼠脑标本边缘系统解剖图切取海马CA3区组织。1%锇酸固定1 h，常规乙醇、丙酮脱水、透明，Epon 812包埋，LKB超薄切片机制备厚度约70 nm超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重染色。取40 000倍放大倍数，每张切片随机选5个视野。采用H-7500型透射电镜(Hitachi公司，日本)观察，采用多点平均法测量突触间隙宽度；参照文献[7]的方法，用游标卡尺测量突触后膜致密物(PSD)厚度和突触活性区长度；参照文献[8]的方法测量突触界面曲率，即突触界面弧长与弦长之比。

2 结果

与C组比较，M组、N组和S组大鼠急性脑梗死后各天逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少(P<0.05)；与M组比较，N组急性脑梗死后各天逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多(P<0.05)；与N组比较，S组急性脑梗死后各天逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少(P<0.05)；M组和S组逃避潜伏期和穿越平台次数比较差异无统计学意义(P>0.05)；与第1天比较，M组、N组和S组第2～5天逃避潜伏期缩短(P<0.05)，见表1。

与C组比较，M组、N组和S组T1～T3海马CA3区突触数减少，间隙增宽，突触后膜致密物厚度变薄，突触活性区长度缩短，突触界面曲率减小(P<0.05)；与M组比较，N组T1～T3海马CA3区突触数增加，间隙变窄，突触后膜致密物厚度变厚，突触活性区长度延长，突触界面曲率增大(P<0.05)；与N组比较，S组T1～T3海马CA3区突触数减少，间隙增宽，突触后膜致密物厚度变薄，突触活性区长度缩短，突触界面曲率减小(P<0.05)；但M组和S组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。超微结构见图1。

表1 四组大鼠各时点逃避潜伏期和穿越平台次数的比较(n=5)

注：*与C组比较，P<0.05；#与M组比较，P<0.05；△与N组比较，P<0.05；▲与第1天比较，P<0.05

表2 四组大鼠术后各时点海马CA3区突触结构参数的比较(n=5)

注：*与C组比较，P<0.05；#与M组比较，P<0.05

3 讨论

急性脑梗死是老年人的常见病、多发病，随着医疗水平的提高，其病死率虽不断下降,但致残率却高达70%～80%。有研究显示，脑梗死不但能导致患者运动功能障碍，还可导致患者认知功能障碍等[9-10]。在欧美等发达国家，急性脑梗死已成为继心血管病、肿瘤和脑血管病之后老年人病死的主要原因，严重影响了患者的身心健康和生活质量，因而如何积极治疗急性脑梗死后认知功能障碍是近年来研究的热点。

参照文献[11]选择腹腔注射NaHS(28 μmol/kg)。Morris水迷宫实验通过定位航线试验测量大鼠获取学习能力，以潜伏期表示；通过空间搜索试验，测量大鼠保存记忆的能力，以跨越原平台次数及平台象限游泳距离表示[12]。本研究结果表明，与C组比较，M组逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少；与M组比较，N组逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多，提示H2S可改善老龄急性脑梗死大鼠认知功能障碍。

海马属边缘系统，在进化上是脑的古老部分。经典的海马结构包括海马本体、齿状回、下托和内嗅皮质4个部分。海马是哺乳类动物学习记忆的重要结构区，其结构和功能具有明显的可塑性，因此常作为学习记忆的研究对象。研究表明，学习记忆障碍可引起海马CA3区突触间隙增大[13]。因此，本研究选择观察海马CA3区突触结构变化。

图1 四组大鼠术后T1～T3海马CA3区突触超微结构(电镜，×40 000)

突触是神经元与神经元之间以及神经元与效应细胞之间相互联系和信息传递的结构，是神经系统可塑性变化最敏感的部位。突触间隙是一个神经元与另一个神经元信息传递的部位，其宽度与形状对突触活动的动力学有重要影响。突触间隙内含有大量神经递质的降解酶，突触间隙越宽，神经递质传导所需的时间越长，在传导过程中被降解的量越多，造成释放至突触间隙内的神经递质大量流失，突触传递有效性明显降低。PSD是位于突触活性区突触后膜下方与胞质相连的一层致密物质，由细胞骨架蛋白和与突触传递密切相关的调节蛋白组成，其含有多种蛋白质和酶，这些蛋白质和酶的构象或数量的变化都可引起PSD超微结构的变化，即厚度的改变，其厚度与学习记忆密切相关。突触活性区长度即PSD的长度，一定程度上代表了突触后膜致密物质的多少。突触界面曲率为活性区弧长与其相对应弦长之比，是突触可塑性的潜在性特征，尤其在中枢神经系统内，突触连接面上所发生的这种形状改变与其功能活动有关。平直型突触的弧长即是弦长，曲率等于1，而弯曲型突触的曲率大于1，可能处于更活化的状态[14]。

本研究结果表明，老龄大鼠急性脑梗死后1、3、7 d时，海马CA3区突触数减少，间隙增宽，突触后膜致密物厚度变薄，突触活性区长度缩短，突触界面曲率减小，提示急性脑梗死后老龄大鼠海马CA3区的突触结构造成损伤；而N组较M组海马CA3区突触数增多，间隙减小，突触后膜致密物厚度增厚，突触活性区长度延长，突触界面曲率增大，提示H2S可减轻急性脑梗死后老龄大鼠海马CA3区突触结构造成的损伤，其机制可能是H2S激活NMDA受体，避免诱发神经元凋亡，对神经发生和突触构建产生增强作用，导致突触素表达上升，此外，还可激活cAMP反应元件结合蛋白的激活，使得突触素基因的表达持续上调[15]。

综上所述，H2S可改善老龄急性脑梗死大鼠认知功能，其机制可能与海马组织CA3区突触结构改变有关，本研究结果不仅为探讨H2S改善认知功能的机制补充了新内容，也为临床上急性脑梗死后认知功能障碍的治疗提供了新思路。

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Effect of hydrogen sulfide on synaptic structure in hippocampal CA3 area in aged rats with acute cerebral infarction

GUO Dan-dan,ZHANG Yi-jie*,LIU Zhi-cheng,CHANG Guo-jiang,LIN Jun,TIAN Miao-miao,SONG Xiao-li

(Department of Neurology,Xiangshan County Red Cross Taiwan Compatriot Hospital,Ningbo 315731,China)

Objective To investigate the effect of hydrogen sulfide on synaptic structure in hippocampal CA3 area in aged rats with acute cerebral infarction.Methods 60 healthy,male SD rats aged 18～20 months,weighing 500～700 g,were randomly divided into 4 groups:control group(group C,n=15),model group(group M,n=15),NaHS group(group N,n=15)and saline group(group S,n=15).NaHS(28 μmol/kg)was given by intraperitoneal injection at 25 min before making the model in group N,and the same amount of saline was given in group S.No process was given in group C.The model of acute cerebral infarction was made by middle cerebral artery occlusion with suture-occluded method in rats.The escape latency and frequency of rats crossing the original platform were recorded by morris water maze.5 rats were chose from each group at 1,3,5 d(T1～T3)after operation and sacrificed,and the hippocampal CA3 area was isolated for examination with electron microscope,the synaptic structure in hippocampal CA3 area was measured.Results Compared with group C,the escape latency was significantly prolonged,the frequency of crossing the original platform and the number of synapses decreased,the width of synaptic cleft increased,the thickness of the postsynaptic density decreased,the length of active zones was significantly shortened,and the curvature of the synaptic interface decreased at T1～T3in group M,group N and group S(P<0.05).Compared with group M,the escape latency was significantly shorten,the frequency of crossing the original platform and the number of synapses increased,the width of synaptic cleft decreased,the thickness of the postsynaptic density increased,the length of active zones was significantly prolonged,and the curvature of the synaptic interface increased at T1～T3in group N.Compared with group N,the escape latency was significantly prolonged,the frequency of crossing the original platform and the number of synapses decreased,the width of synaptic cleft increased,the thickness of the postsynaptic density decreased,the length of active zones was significantly shortened,and the curvature of the synaptic interface decreased at T1～T3in group S(P<0.05).Conclusion Hydrogen sulfide can improve cognitive function in aged rats with acute cerebral infarction,and the mechanism may be associated with the changes of synaptic structure in hippocampal CA3 area.

Hydrogen sulfide;Cognitive function;Acute cerebral infarction;Hippocampus;Synapses

2014-03-02

象山红十字台胞医院神经内科，宁波 315731

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201504003