人BMP-2体外定向诱导犬BMSCs向成骨方向分化的实验研究*

许蕾 韩建国 李家锋

(1.徐州医学院口腔医学院，江苏徐州221004;2.徐州医学院附属医院口腔颌面外科，江苏徐州221002)

人BMP-2体外定向诱导犬BMSCs向成骨方向分化的实验研究*

许蕾1韩建国1李家锋2

(1.徐州医学院口腔医学院，江苏徐州221004;2.徐州医学院附属医院口腔颌面外科，江苏徐州221002)

目的通过将犬骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymal stem cells，BMSCs)建立体外培养体系，运用人骨形态发生蛋白-2(bonemorphogenetic protein-2，BMP-2)体外定向诱导分化为成骨细胞，为后期建立骨组织工程提供种子细胞。方法提取比格犬BMSCs，全骨髓贴壁法结合密度梯度离心法行体外分离培养，每日观察细胞生长变化。将生长形态良好的第3代BMSCs分成两组，实验组加入200 ng/m l人BMP-2的含血清培养基对其进行成骨诱导培养，对照组只用含血清的完全培养基培养，于诱导3周后行碱性磷酸酶染色、诱导4周后行茜素红染色与Von-Kossa染色以鉴定分化的成骨细胞。结果诱导3周后实验组碱性磷酸酶染色示细胞胞质内黑色颗粒阳性表达，对照组为阴性;诱导4周后实验组茜素红染色以及Von-Kossa染色均呈钙结节阳性表达，对照组均为阴性。实验组染色结果都表达成骨细胞的特性。结论体外分离培养的比格犬BMSCs，在诱导剂人BMP-2的作用下可以向成骨细胞定向分化。

骨髓间充质干细胞;骨形态发生蛋白-2;成骨分化;骨组织工程

临床上较多患者因外伤、肿瘤或先天性疾病等原因造成牙槽骨缺损而不能满足种植修复的要求，骨组织工程的出现改变了骨缺损患者难种植的局面，且在多年的研究中得到了快速的发展［1］。组织工程骨由种子细胞、生物支架和生长因子三部分组成，其不仅能修复缺损的骨质，还能促进新生骨的形成。目前骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是研究较成熟的种子细胞［2］，它具有干细胞多向分化的潜能，能在体外培养条件下向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞多向分化［3］。本实验运用骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)对BMSCs进行成骨定向诱导，在倒置显微镜下密切观察细胞的生长形态变化，通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色以及Von-Kossa染色来评价诱导细胞的性质，为修复种植体周围骨缺损的实验研究提供较为理想的种子细胞。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器DMEM/F12培养液(美国Thermo公司);胎牛血清(美国Hyclone生物制品公司);Human BMP-2(美国Peprotech公司);Motic倒置相差显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)

1.2 BMSCs的分离与培养取1只12月龄健康成年比格犬，雌雄不限，由徐州医学院动物实验中心提供，0.5 mg阿托品麻醉前15 min注射，3%戊巴比妥(1 m l/kg)行犬股骨外侧肌注麻醉后抽取骨髓10 m l，肝素抗凝，2000 r/min离心10 min，吸取中间白色絮状单核细胞层，细胞以1×108/ml的密度接种于25 cm2塑料培养瓶中，加入3～5 m l DMEM/F12培养基(10%胎牛血+0.1%青链霉素)，混匀后于37℃，5%CO2培养箱中孵育。原代48 h首次换液，此后每2～3 d换液1次，并在倒置显微镜下观察BMSCs的形态生长变化。当原代细胞处于80%～90%融合阶段时，加入胰蛋白酶细胞消化液，以1:2进行消化传代。

1.3 BMSCs的成骨诱导培养取体外扩增且生长活力旺盛的第3代BMSCs，以2×104个/孔接种于多块预先放入细胞爬片的6孔板中。实验分为两组，实验组的6孔板中加入诱导培养基(200 ng/ml BMP-2+10%胎牛血+0.1%青链霉素)，对照组的6孔板仍用完全培养基(10%胎牛血+0.1%青链霉素)，于37℃、5%CO2培养箱进行培养，每日于倒置显微镜下观察及记录细胞形态变化。

1.4 碱性磷酸酶染色采用改良钙钴法进行染色，将实验组与对照组诱导3周的6孔板的细胞爬片取出，4%多聚甲醛固定30 min，2%硝酸钴5 min，1%硫化铵5min，1%中性红染色1min，冲洗后干燥，封片，显微镜下观察与拍照。

图1 BMSCs原代48h，细胞呈短梭形(×100)

1.5 茜素红染色将诱导4周的实验组与对照组的6孔板中的细胞爬片取出，4%多聚甲醛固定30 min，冲洗烘干后浸入新鲜的0.1%茜素红-Tris-Hcl (pH 4.2)溶液中37℃水浴2 h，冲洗后干燥，封片，显微镜下观察与拍照。

1.6 Von-Kossa染色鉴定取出实验组与对照组诱导4周后的细胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min，加入现配的2%硝酸银溶液1 ml，紫外线下面静置1 h，换用5%硫代硫酸钠溶液作用1 ml，1%中性红染色30 min，冲洗干燥后显微镜下观察与拍照。

2 结果

2.1 细胞生长形态变化倒置显微镜下观察，成年比格犬BMSCs原代培养48h时，细胞呈短梭形或纺锤形，多数呈单个贴壁生长分散于大量的杂细胞中(图1)。随着传代与换液，细胞得以纯化，呈成纤维细胞样，且在传代后细胞的形态基本保持不变。传至第3代时，细胞呈长梭型，贴壁及增长速度逐渐加快，生长密集，有一定的方向性，整体呈漩涡状或螺旋状排列(图2)。成骨诱导3周的BMSCs体积增大，形态可多样，梭形或多角形，可呈“铺路石”样排列，胞质内可见散在的颗粒状物质及空泡(图3)。

2.2 碱性磷酸酶染色结果碱性磷酸酶是鉴定成骨细胞的标志，主要分布在成骨细胞胞质内基质小泡的膜上。实验组染色结果为阳性，细胞的胞质内可见散在分布的黑色颗粒(图4);对照组呈阴性。

2.3 茜素红染色结果实验组细胞呈阳性，肉眼可见钙盐沉积，镜下观察到细胞外基质中散在出现致密不透光的褐色矿化结节，中心呈黑色，呈圆形或卵圆形(图5);对照组呈阴性。

2.4 Von-Kossa染色结果实验组细胞诱导4周后，细胞密集，形成细胞团，有些密集区域的细胞可多层重叠，边界不清，细胞分泌较多的细胞外基质，并且包裹细胞形成细胞结节即钙结节，结节中心出现基质沉积，主要出现在细胞密集区，呈黑染(图6);对照组细胞呈阴性。

图2 第3代BMSCs呈长梭形，细胞排列似漩涡状(×100)

图3 BMSCs成骨诱导3周，细胞排列呈“铺路石”样(×100)

图5 茜素红染色结果呈阳性，细胞聚集区可见红褐色的钙化结节(×100)

图4 碱性磷酸酶染色结果为阳性，细胞的胞浆内可见散在分布的黑色颗粒(×100)

图6 Von-Kossa染色结果呈阳性，细胞密集区有黑色的钙结节形成(×40)

3 讨论

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一类存在于骨髓基质中易于贴壁的纺锤状的细胞，由于其取材容易、体外易于分离培养及自体回植、有多向分化潜能等特征，被广泛作为种子细胞用于骨组织工程中。目前用于BMSCs体外分离培养的方法主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠分离法、流式细胞分选法。

全骨髓贴壁法［4］是将提取的骨髓稀释后直接加培养基培养，通过换液去除不贴壁的悬浮细胞使BMSCs纯化，该方法简单但获取的细胞纯度不高;密度梯度离心法是根据骨髓中各细胞成分比重的不同用细胞分离液进行分离，此法获取细胞的纯度较高，但其操作严格不易掌握;免疫磁珠分离法［5］成本较高［6-7］，流式细胞分选法操作又繁琐，一般均较少采用。本实验结合全骨髓贴壁法与密度梯度离心法来分离细胞，将提取的骨髓通过离心后因细胞比重不同而出现分层，其中间的白色絮状层就是BMSCs所在细胞层，可直接置于低血清培养液中培养，此方法操作简单，经济成本低，对细胞损伤小，细胞可快速贴壁并大量增殖，可将细胞在短时间内快速纯化，缩短实验周期。

BMSCs的多向分化能力导致了我们需要借助特定的诱导剂才能将BMSCs向成骨细胞定向分化。近年来，多种诱导剂被参与到实验研究中，如经典的将10-7mol/L地塞米松、10-2mol/Lβ-磷酸甘油和50 mg/L的L-抗坏血酸联合起来的含血清诱导培养基，以及透明质酸［8］、骨形态发生蛋白-2［9］(BMP-2)、富血小板血浆(PRP)、碱性成纤维细胞生长因子［10］等，其中BMP-2展现出较好的研究应用背景，被广泛用于实验研究中。

骨形态发生蛋白(BMPs)最初是从牛的异位骨化结果中发现并分离出来的一种蛋白质，属于转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员［11］，是一类具有很强的诱导间叶细胞成骨分化的因子，以二聚体的形式存在于生物体内。BMP-2是BMPs中的一员，很久以来被证实是成骨诱导能力最强之一，能诱导未分化的间充质干细胞不可逆的向成骨细胞定向分化与增殖，促进成骨细胞分化成熟，通过钙盐沉积，参与骨的形成与重建［12-13］，具有高效的异位诱导成骨以及跨种属诱导成骨作用，但对已分化成熟的成骨细胞和软骨细胞无生物学效应。Maegawa［14］、Varkey［15］等研究表明BMP-2可以在体外引导BMSCs向成骨细胞分化;张为西等［16］也验证出BMSCs经100μg/L BMP-2诱导，ALP活性增高，钙结节形成，分化为成熟的成骨细胞。本实验用人的BMP-2对犬的BMSCs进行跨种属诱导，且以200 ng/m l的有效浓度持续培养，成功的使BMSCs向成骨细胞分化。

ALP是成熟成骨细胞的标志之一［17］，在BMSCs骨化过程中发挥了重要作用，与钙离子复合后可以粘附在胶原蛋白上形成矿化物，所以我们不仅可以通过检测ALP的活性水平来检测出诱导的成骨细胞，也可以直接通过对矿化物的检测来证明成骨细胞的存在。本实验中，无论是ALP染色后细胞质中黑染的颗粒状物质，还是茜素红染色与Von-Kossa染色后黑色深染的钙结节都证明了这一点，BMSCs已向成骨细胞分化。

综上所述，体外分离培养的犬BMSCs在诱导剂BMP-2的作用下可以向成骨细胞定向分化，可作为骨组织工程的种子细胞。

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Experimental study of human BMP-2 on osteogenic induction in BMSCs of dogs in vitro

XU Lei1HAN Jian-guo1LI Jia-feng2
(1.School of Stomatology，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China; 2.Dept.of Oral Maxillofacial Surgery，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002，China)

Objective:To provide seed cells for bone tissue engineering in the late establishment by establishing the culture system of bonemarrow mesenchymal stem cells(BMSCs)of dogs in vitro，and using human BMP-2 to make them induced to differentiate into osteoblasts.Methods:The extraction of BMSCs of adult beagle dogs was made，then the whole marrow adherencemethod and density gradient centrifugation were used to isolate and culture BMSCs in vitro，and observe the cell growth morphology everyday.The third generation BMSCs with good growth form was divided into two groups.The experimental group were cultured with adding 200ng/m l human BMP-2 containing fetal bovine serum(FBS)while the control group were cultured only with completemedium containing FBS.Then we used the detection of alkaline phosphatase staining after 3 weeks＇induction，alizarin red staining and Von-Kossa staining after4 weeks＇induction to identify the differentiation of osteoblasts.Results:After3 weeks of induction of experimental group with alkaline phosphatase，staining showed the cytoplasm of positive expression of black particles，and itwas negative in the control group;After4 weeks of induction ofexperimental group with alizarin red staining and Von-Kossa staining showed positive expression of calcium nodules，and it was negative in the control group.All the staining results in the experimental group showed the characteristics of osteoblasts.Conclusion:BMSCs of dogs，which are extracted and cultivated in vitro，can directionally differentiate into osteoblasts under the action of human BMP-2.

bonemarrow mesenchymal stem cells;BMP-2;osteogenesis differentiation;bone tissue engineering

R780.2

A

1004-7115(2015)09-0971-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.09.001

2015-03-19)

许蕾(1989—)，女，江苏苏州人，硕士研究生，研究方向:口腔颌面外科。

韩建国，硕士生导师，教授，主任医师，主要从事牙体牙髓病学临床和基础研究。