己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

李泉源 魏涧 严礼琴 王群

己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

李泉源 魏涧 严礼琴 王群

目的 探讨己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌及癌旁正常乳腺组织中的表达与临床意义。 方法 收集2002年7月至2009年7月在我院接受手术治疗的71例乳腺癌患者的手术标本，所有肿瘤组织均经术后病理学检测结果证实，通过免疫组织化学方法检测己糖激酶-Ⅱ蛋白在乳腺癌及癌旁正常组织中的表达，并探讨其表达量与临床病理特征和预后的相关性。 结果 乳腺癌组织中己糖激酶-Ⅱ的阳性表达率为70.4%，显著高于癌旁正常乳腺组织中的11.3% (P<0.05)；进一步研究发现，己糖激酶-Ⅱ的阳性表达情况与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、分化程度和病理类型无关，与患者的有无淋巴结转移及临床分期相关(P<0.05)；己糖激酶-Ⅱ阳性表达的患者5年生存率显著低于阴性表达的患者(P=0.026)。 结论 己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌组织中的表达明显升高，对乳腺癌患者的预后判断具有重要意义。

乳腺癌； 己糖激酶-Ⅱ; 靶向治疗

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，在我国的发病率呈现逐年增加的趋势[1]，目前在临床上主要采取以手术为主,辅以化疗、放疗和内分泌治疗的综合性治疗。近年来随着乳腺癌改良根治术的逐步推广，手术切除范围的缩小，化疗已经成为乳腺癌治疗中的常规性手段[2]。然而，现有的化疗药物存在较大的细胞毒性，因此，寻找新型、高效的靶向性药物对于其治疗具有重要意义。己糖激酶-Ⅱ(Hexokinase Ⅱ)已经证实在多种肿瘤组织中高表达，本文通过研究其在乳腺癌组织中的表达，以期为乳腺癌的治疗提供新的思路和方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2002年7月至2009年7月在我院接受手术治疗并经过术后病理证实的乳腺癌患者71例，入选患者年龄35～79岁，平均(56.0±7.6)岁，分别选取乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织各71块进行分析。本研究经过我院伦理委员会批准，患者术前均签署知情同意书。收集的资料包括患者姓名、年龄、术前术后辅助检查的结果、病理分期和治疗情况等。本研究对象中排除术前接受过放疗、化疗治疗的患者，所有患者每隔2月通过电话或者来院随访，随访期限为5年。

1.2 免疫组织化学和HE染色 取乳腺癌术中切除的新鲜肿瘤组织标本经10%福尔马林固定，行常规石蜡包埋，石蜡标本行4 μm厚连续切片，60 ℃烤片8 h备用。将石蜡切片脱蜡和水化，PBS冲洗3次，每次3 min。蒸馏水浸泡冲洗后行抗原修复，用EDTA缓冲液100 ℃修复20 min，自然冷却至室温。蒸馏水冲洗2次后，PBS冲洗2次，每次3 min。滴加过氧化酶阻断溶液，室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3 min。滴加动物非免疫血清，室温孵育10 min，倾去。滴加一抗己糖激酶-Ⅱ(购自美国santa cruz公司，1∶50稀释)，室温孵育60 min，阴性对照用PBS代替。PBS冲洗3次，每次3 min。滴加生物素标记的二抗 (美国santa cruz公司，羊抗兔IgG)，室温孵育10 min。PBS冲洗3次，每次3 min。滴加5 μl链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液，室温孵育30 min。PBS冲洗3次，每次3 min。DAB显色剂显色。自来水冲洗后，苏木素复染，自来水冲洗返蓝，酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。HE染色按照标准流程操作。

免疫结果判断标准参照以往文献[3-4]，采用半定量积分法，由3位有经验的病理科医师分别判读，采用双盲法对每张切片在高倍镜下(×400)计数15个视野，平均100个细胞中己糖激酶-Ⅱ阳性细胞的个数作为阳性细胞率。免疫组化阳性结果判定标准为细胞浆中出现棕黄色颗粒，评分标准：阴性为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。最终结果判定：0～2分为阴性，3分为阳性；阳性细胞的百分比判断标准: 0～5%为阴性表达，6%～25%为弱阳性，26%～75%为中度阳性，>76%为强阳性，弱阳性、中度阳性和强阳性定义为阳性结果。

1.3 统计分析 采用SPSS 17.0 软件进行统计学处理，计数资料采取χ2检验，用Kaplan-Meier 法进行生存分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 己糖激酶-Ⅱ蛋白在乳腺癌组织中的表达 乳腺癌组织中己糖激酶-Ⅱ的染色主要为胞浆阳性，染色为淡黄色、棕黄色和棕褐色，己糖激酶-Ⅱ阳性细胞在癌旁正常组织中明显减少 (图1)，统计结果表明己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌组织中的阳性率高达70.4%(50例)，显著高于癌旁正常乳腺组织的11.3%(8例)(P<0.05)。

图1 乳腺癌和癌旁正常组织中己糖激酶-Ⅱ的免疫组织化学染色检测结果(×400)

2.2 己糖激酶-Ⅱ蛋白的表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系 己糖激酶-Ⅱ的阳性表达率与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、病理分型和分化程度无关(P>0.05)，与有无淋巴结转移和临床分期相关(P<0.05)。见表1。

表1 己糖激酶 Ⅱ与乳腺癌患者临床病理特征间的关系(n,n=71)

组别己糖激酶Ⅱ阳性例数阴性例数P年龄(岁)<5019120.14≥50319肿瘤大小<3cm30120.92≥3cm209病理分型导管癌26100.97小叶癌146髓样癌72混合癌33TNM分期Ⅰ期5100.004Ⅱ期197Ⅲ期264分化程度高分化1050.61中分化2210低分化186淋巴结转移有2630.006无2418

2.3 己糖激酶-Ⅱ蛋白的表达与乳腺癌患者临床预后的关系 己糖激酶-Ⅱ阳性表达的患者中位生存期为32月，阴性表达的患者中位生存期为52.5月。己糖激酶-Ⅱ阴性表达的乳腺癌患者5年生存率明显高于己糖激酶-Ⅱ阳性表达的患者(P<0.05)。见图2。

图2 己糖激酶-Ⅱ蛋白阳性表达患者和阴性表达患者的Kaplan-Meier生存曲线图

3 讨论

与正常组织相比，肿瘤组织的能量代谢发生明显改变：正常的组织细胞主要通过葡萄糖的有氧分解获取能量，肿瘤细胞内由于酶谱的变化，即使在有氧条件下也以无氧酵解获取能量[5]。己糖激酶是肿瘤组织中糖酵解的限速酶，在肿瘤组织中其表达量和活性明显增加，从而使肿瘤组织在无氧条件下也能通过无氧酵解来保证足够的能量来源[6]。此外，糖酵解的中间产物可以被肿瘤组织利用，用来合成肿瘤生长的必要物质。己糖激酶是糖酵解的第1个限速酶，一共有4种亚型，Ⅱ型是胰岛素敏感型，正常情况下仅在人体内的肌肉和脂肪组织中呈现少量表达，并且多数以游离形式存在于细胞质中，研究发现在肝癌、肺癌及宫颈癌组织中己糖激酶-Ⅱ的表达明显增加，以线粒体结合型为主，且在肿瘤中心部位的表达量显著高于肿瘤周边部位，与低氧状态下诱导其表达相关[7]。此外，研究发现己糖激酶-Ⅱ的表达量与肿瘤的恶性程度存在显著正相关性[3]。体外细胞实验和动物体内实验发现己糖激酶-Ⅱ在肿瘤组织的发生、发展和侵袭中发挥重要的作用，靶向己糖激酶-Ⅱ的治疗已经成为多种肿瘤治疗的热点[8]。

本研究结果发现，己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌患者肿瘤组织中的表达量明显升高，这与以往研究结果一致[9]，进一步研究发现乳腺癌组织中己糖激酶-Ⅱ的表达与患者的临床分期和有无淋巴结转移密切相关，与年龄、分化程度、病理类型无关，说明己糖激酶-Ⅱ升高是乳腺癌肿瘤组织中的共性，同时是影响患者的临床预后的重要因素，目前，已经研发出多种己糖激酶-Ⅱ的抑制剂，最近的一项研究表明己糖激酶-Ⅱ的选择性抑制剂3-BrPA可以显著抑制乳腺癌细胞中ATP的产生和上调氧化应激的水平[10]，从而抑制乳腺癌细胞的增殖和凋亡[11]，提示靶向己糖激酶-Ⅱ的药物对于乳腺癌的治疗可能具有重要意义，未来需要在体内动物实验中进一步研究己糖激酶-Ⅱ对乳腺癌的治疗作用，以期为临床上乳腺癌的治疗打下坚实的理论基础。

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Expression of Hexokinase Ⅱ in breast carcinoma and correlation with the clinicopathologic characteristics

LIQuan-yuan,WEIJian,YANLi-qin.DepartmentofBreastSurgery,DongfengHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China;WANGQun.TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China

Objective To investigate the expression of Hexokinase Ⅱ in breast carcinoma, and to discuss the relationship between positive expression and clinical characteristics of breast carcinoma. Methods Seventy-one patients with breast carcinoma in our hospital from July 2002 to July 2009 were included in this study. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of Hexokinase Ⅱ in breast carcinoma and normal tissues. All the specimens were confirmed by pathology. The correlation between the expression of Hexkinase Ⅱ and clinical characteristics of patients was analyzed. Furthermore, survival analysis was performed to study the relation between expression levels of Hexokinase Ⅱ and prognosis. Results The positive expression rate of Hexokinase Ⅱ in breast carcinoma and normal tissues was 70.4% and 11.3% respectively. Statistical analysis demonstrated that the positive expression rate of Hexokinase Ⅱ showed no significant correlation with age, histologic type, degrees of pathdogical differentiation and tumor size, but was related to clinical stage and lymph node metastasis (P< 0.05). According to the survival analysis the Hexokinase Ⅱ positive-expression group showed poorer overall survival rate compared with negtive-expression group (P=0.026). Conclusions The expression of Hexokinase Ⅱ is increased in breast carcinoma, and holding certain reference value for estimating prognosis of breast carcinoma patients.

breast carcinoma; Hexokinase Ⅱ; target treatment

湖北省教育厅课题(Q20132107)

442000湖北省十堰市，湖北医药学院附属东风医院乳腺外科(李泉源，魏涧，严礼琴)；442000湖北省十堰市，湖北医药学院附属太和医院(王群)

魏涧，Email：weij4203@163.com

R 541.6

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.07.018

2014-09-15)